流式細胞儀原理及操作步驟.doc

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1、流式細胞儀原理及操作步驟流式細胞儀(FCM)是八十年代集單克隆抗體、熒光化學、激光、計算機等高技術發(fā)展起來的一種先進儀器，已廣泛應用于免疫學、生物化學、生物學、腫瘤學以及血液學等方面的研究和臨床常規(guī)工作。其中檢測人白細胞表面標志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細胞群和亞群進行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細胞?；罴毎庖邿晒饧夹g是用于FCM檢測的標本準備，染色后也能在熒光顯微鏡下進行觀察，在某些實驗條件下，活細胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優(yōu)于滴片固定的常規(guī)間接免疫熒光的結果?！　?一)　原理　　活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源

2、性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據(jù)所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布?！　?二)　操作步驟　　　　　制備活性高的細胞懸液(培養(yǎng)細胞系、外周血單個核細胞、　　　　　胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法)　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640調(diào)整細胞濃度為　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　取40μl細胞懸液加入預先有特異性McAb(5～50μl)　　　　　　　　的小玻璃管或塑料離心管，再加50μl1∶20(用DP

3、BS　　　　　　　　稀釋)滅活正常兔血清　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃30min　　　　　　　　用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　棄上清，加入50μl工作濃度的羊抗鼠　　　　　　　　　(或兔抗鼠)熒光標記物，充分振搖　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4℃30min　　　　　　　　　用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　加適量固定液(如為FC

4、M制備標本，一般加入　　　　　　　　　1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，　　　　　　　　　視細胞濃度加入100～500μl固定液)　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察　　　　　　　　　　(標本在試管中可保存5～7天)　　(三)　試劑和器材　　1.　各種特異性單克隆抗體。　　2.　熒光標記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。　　3.　10％FCSRPMI1640,DPBS、洗滌液、固定液(見附錄)?！　?.　玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等?！　?四)　注意事項　　1.　整個操作在4℃下進行，洗滌液

5、中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN３，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落?！　?.　洗滌要充分，紅外碳硫儀以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現(xiàn)假陰性?！　?.　加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。　　4.　細胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色?！　「?　　1.DPBS(×10,貯存液)　　　　NaCl80g　　　　KCl2g　　　　　蒸餾水加至1000ml　　　　Na２HPO４11.5g臨用時用蒸餾水1∶10稀釋　　　　KH２PO４2g　　2.　洗滌液　　　　DPBS　　　　　　900ml

6、　　　　FCS50ml(終濃度　5％)　　　　4％NaN３　　　50ml(終濃度0.2％)　　3.　固定液　　　　DPBS　　　　1000ml　　　　葡萄糖　　　　20g(終濃度2％)　　　　甲　醛　　　　10ml　　　　NaN３　　　0.2g(終濃度0.02％)