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1、學(xué)校代碼：10564學(xué)號：2013202533分類號：S858.28密級：碩士學(xué)位論文豬塞內(nèi)加谷病毒（SVV）的分離鑒定及致病性研究趙曉亞指導(dǎo)教師：馬靜云副教授學(xué)院名稱：動(dòng)物科學(xué)學(xué)院專業(yè)名稱：動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)答辯委員會主席：畢英佐研究員中國·廣州2016年6月華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。作者簽名：日期：學(xué)位論文提交
2、同意書本學(xué)位論文符合國家和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)關(guān)于研究生學(xué)位論文的相關(guān)規(guī)定，達(dá)到學(xué)位授予要求，同意提交。導(dǎo)師簽名：日期：學(xué)科帶頭人簽名：日期：摘要豬塞內(nèi)加谷病毒（SenecaValleyvirus，SVV）屬于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）Senecavirus病毒屬成員，可引起豬鼻鏡及蹄冠處出現(xiàn)水皰、潰爛創(chuàng)面從而導(dǎo)致跛足甚至死亡。本研究采用傳代細(xì)胞(豬腎細(xì)胞)從豬組織器官研磨物中分離出4株SVV，分別命名為SVVCH-01-2015、SVVCH-02-2015、SVVCH-03-2015、SVVCH-04-2015。并對4株SVV中國分離株進(jìn)行全基因組序列測定。根據(jù)發(fā)表在Gen
3、BankSVV保守序列3C基因，設(shè)計(jì)特異性引物和探針；構(gòu)建含3C基因序列的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，建立針對SVV檢測的TaqManReal-TimePCR檢測方法。將SVV細(xì)胞分離株攻毒4日齡健康仔豬，觀察臨床癥狀、病理變化，檢測感染動(dòng)物組織器官中的病毒載量。病毒分離鑒定結(jié)果表明：病毒分離液在第一代24h后即可產(chǎn)生CPE，隨著傳代次數(shù)的增加，出現(xiàn)CPE的時(shí)間縮短，細(xì)胞病變程度亦隨之加劇，且可在PK-15細(xì)胞上穩(wěn)定增殖。全基因組序列比對結(jié)果表明，SVVCH-01-2015與SVVCH-02-2015、CH-03-2015、SVVCH-04-2015的相似性為97.6%；SVVCH-02-20
4、15與SVVCH-03-2015、SVVCH-04-2015的相似性為99.9%；SVVCH-03-2015與SVVCH-04-2015的相似性為100%。4株SVV中國分離株與2008年美國分離株SVV-001相比，相似性為94.3%-94.4%之間；SVVCH-01-2015與2015年美國新分離株USA/IA46008/2015和USA/IA40380/2015相似性均為96.8%；SVVCH-02-2015、SVVCH-03-2015、SVVCH-04-2015與2015年美國新分離株USA/IA46008/2015和USA/IA40380/2015相似性均為98.0%；SVVCH
5、-01-2015與2015年巴西新分離株SVV/BRA/GO3/2015、SVV/BRA/MG1/2015、SVV/BRA/MG2/2015相似性均為97.1%；SVVCH-02-2015、SVVCH-03-2015、SVVCH-04-2015與2015年巴西新分離株SVV/BRA/GO3/2015、SVV/BRA/MG1/2015、SVV/BRA/MG2/2015相似性均為98.2%；SVVCH-01-2015與SVVCH-03-2015、SVVCH-04-2015與加拿大株11-55910-3相似性均為96.7%；SVVCH-02-2015與加拿大株11-55910-3相似性均為96.
6、6%。4株SVV中國分離株均位于Senecavirus病毒屬，與Senecavirus病毒屬毒株同源性最高，由此可以確定所分離到的4株均屬于Senecavirus病毒屬。TaqManReal-TimePCR檢測方法的結(jié)果顯示，TaqManReal-TimePCR用標(biāo)準(zhǔn)品2所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（R）達(dá)到0.999以上；可以檢測到標(biāo)準(zhǔn)品下限濃度為12×10copies/μL；只以SVV的cDNA為模板的反應(yīng)呈現(xiàn)陽性熒光信號，而以其它病毒I的cDNA/DNA為模板所進(jìn)行的Real-TimePCR均未檢測到陽性熒光信號；組內(nèi)與組間試驗(yàn)的變異系數(shù)均在0.96以下。本研究建立的TaqManReal
7、-TimePCR方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。TaqManReal-TimePCR檢測方法的成功建立，為SVV的定性檢測和定量分析提供了有效的技術(shù)平臺。動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果表明：（1）運(yùn)用人工感染方式成功在4日齡仔豬身上發(fā)現(xiàn)臨床癥狀和病理變化，證明SVV對仔豬具有致病性。（2）通過同居感染處理證明SVV可能是一種接觸傳染病且傳播速度較快。（3）SVV可在4日齡仔豬內(nèi)體成功復(fù)制且病毒可能在肺、脾、扁桃體、腦部和心臟中成功
