基于聚吡咯修飾膨脹石墨電極的甲胎蛋白電化學(xué)免疫傳感器.pdf

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1、第41卷分析化學(xué)(FENXIHUAXUE)研究報(bào)告第8期2013年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl199—1203DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．21158基于聚吡咯修飾膨脹石墨電極的甲胎蛋白電化學(xué)免疫傳感器陳學(xué)梅謝愛娟孔泳楊艷偉-5+峰周民。(南京化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南京210048)(常州大學(xué)石油化工學(xué)院，常州213164)。(常州市第二人民醫(yī)院，常州213000)摘要構(gòu)建了測定人血清中甲胎蛋白(AFP)的電化學(xué)免疫傳感器。此免疫傳感器的制備采用恒電位

2、法在膨脹石墨(EG)電極表面合成聚吡咯(PPy)，再以戊二醛(GA)作為交聯(lián)劑，固定辣根過氧化酶標(biāo)記的AFP抗體(HRP—anti-AFP)。此免疫傳感器在含AFP的溶液中于35℃溫育50min后，再在傳感器表面修飾普魯士藍(lán)(PB)作為電子介體，抗原抗體免疫結(jié)合產(chǎn)生的免疫復(fù)合物會導(dǎo)致HRP對PB催化氧化的效率降低。在優(yōu)化條件下，AFP的濃度在0．01—300g／L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為6．25pg／mL(S／N=3)。這種基于PPy修飾EG電極的免疫傳感器制備簡單，靈敏度高且價(jià)格低廉，有望成為一次性電化學(xué)免疫傳感器

3、。關(guān)鍵詞甲胎蛋白；膨脹石墨；電化學(xué)免疫傳感器；酶標(biāo)抗體；普魯士藍(lán)1引言甲胎蛋白(AFP)是一種胚胎發(fā)育早期的主要血清蛋白，成人由肝細(xì)胞產(chǎn)生，含量極微，血清中AFP的升高對原發(fā)性肝癌診斷具有重要意義J。目前，放射免疫法(RIA)是公認(rèn)的準(zhǔn)確測定AFP的方法，但存在放射性污染。近年來，各種采用非放射性標(biāo)記的免疫技術(shù)相繼建立，并得到迅速發(fā)展。免疫傳感器是耦聯(lián)含有抗原抗體分子的生物敏感膜與信號轉(zhuǎn)換器的一種新型生物傳感器，其測定原理基于抗原(或半抗原)和其特異性抗體結(jié)合形成穩(wěn)定的抗原抗體復(fù)合物J。電化學(xué)免疫傳感器由于具有很高的特

4、異性和靈敏度而成為近年來的研究熱點(diǎn)之一_3，4J。然而，該類傳感器常需要采用鉑、金等貴金屬或者玻碳作為電極材料，這些電極價(jià)格昂貴，限制了可拋棄型電化學(xué)免疫傳感器的發(fā)展。因此，基于一次性傳感表面的可拋棄型電化學(xué)免疫傳感器的研究顯得尤為重要。有關(guān)絲網(wǎng)印刷電極在電化學(xué)免疫傳感器中的應(yīng)用已有報(bào)道_5]，這類電極的主要優(yōu)點(diǎn)在于可批量生產(chǎn)、一次性使用、檢測操作簡單等。膨脹石墨(EG)作為一類新型炭材料，具有良好的導(dǎo)電性和化學(xué)穩(wěn)定性j，且制備容易，符合基底電極的要求J。聚吡咯(PPy)是一類功能高分子，可用于制作直接電化學(xué)電極功能基

5、質(zhì)膜。聚合物包埋法是一種傳統(tǒng)的抗體固定化方法J，然而包埋法可能會使抗體變性，失去活性。而且大部分的抗體包埋于聚合物基底中，不能與抗原有效結(jié)合J。本研究將PPy膜修飾到EG電極上，利用其活性基團(tuán)(亞氨基)與交聯(lián)劑戊二醛(GA)的一個(gè)醛基發(fā)生交聯(lián)；GA上的另一個(gè)醛基用于結(jié)合辣根過氧化酶標(biāo)記的AFP抗體(HRP—anti—AFP)。然后在傳感器表面修飾一層普魯士藍(lán)(PB)，由于PB具有較好的電化學(xué)活性，因而可用于電子介體。酶標(biāo)抗體上的HRP能催化PB的電化學(xué)氧化，因此根據(jù)峰電流的大小變化，可確定待測樣品中AFP的含量，從而制

6、備了AFP免疫傳感器。2實(shí)驗(yàn)部分2．1儀器與試劑JSM-6360LA型掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)，CHI660D型電化學(xué)工作站(華科普天科技有限公司)。AFP酶聯(lián)免疫試劑盒(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)。兩份人血清樣品由常州市第二人民醫(yī)院提供。2012．11-14收稿；2013-02~8接受本文系國家自然科學(xué)基金(No．21275023)，江蘇省自然科學(xué)基金(No．BK2012593)，江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程(PAPD)資助項(xiàng)目十E-mail：yzkongyong@yahoo．corn．cn1200分析化學(xué)第

7、41卷2．2基于聚吡咯修飾膨脹石墨電極的AFP免疫傳感器的構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)[10]，將天然鱗片石墨氧化后制備EG。稱取0．07gEG，用壓片機(jī)壓制成片狀的EG電極。將面積為1x0．5cm的EG電極浸人到含0．15moL／L吡咯，0．2mol／LNaC1中作為工作電極，分別以鉑片和飽和甘汞電極(SCE)作為對電極和參比電極，在工作電極上施加0．8V的電位使吡咯單體在EG電極表面發(fā)生聚合。聚合150S后，將EG電極取出，用去離子水洗凈，在室溫下干燥，即得到PPy膜修飾的EG電極。將該修飾電極浸入到2．5％GA溶液中活化5h，得

8、到膨脹石墨／聚ptt~／戊二醛(EG／PPy／GA)電極。將10txLHRP．a(chǎn)nti-AFP滴加到電極表面，在35℃下溫育50rain，再用pH7．4的PBS沖去松散結(jié)合的酶標(biāo)抗體，晾干；在固定了酶標(biāo)抗體的傳感器表面滴加320LAFP抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于考察該免疫傳感器的最佳工作條件。2．3普魯士藍(lán)的固定及免疫傳感分析三電極系統(tǒng)：