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1、莼菜多糖的分離純化PPT制作：丁楚蔚、汪心妍匯報人：丁楚蔚背景資料：譚曉菁、江淑華研究背景實驗步驟與結(jié)果總結(jié)與展望目錄研究背景1莼菜睡蓮科，多年生水生草本植物，又名馬蹄草，有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖、降血脂等功效，含酸性多糖、多酚、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、組胺及微量元素，多糖在莼菜干品中所占的比例最高，主要分布于葉底部、莖周圍的黏液質(zhì)中，是莼菜發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。方法流程采用堿提醇沉工藝，經(jīng)除蛋白、除色素得到莼菜多糖(BSP)再經(jīng)DEAE纖維素DE-52柱SepharoseCL-6B瓊脂糖凝膠柱對BSP進行分級精制采用高效凝膠過濾色譜(HPGFC)測定B
2、SP各組分的分子量儀器與材料儀器材料Agilent1200HPLC色譜儀AE240分析天平UV-2102PC紫外可見分光光度計FD-1C-55凍干機旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀超濾儀DZG-6020減壓干燥箱莼菜嫩葉；無水乙醇；NaOH；鹽酸；木瓜蛋白酶；聚酰胺樹脂；DEAE纖維素DE-52；瓊脂糖凝膠SepharoseCL-6B；透析袋；蒽酮、硫酸；純化水粗多糖的提取莼菜粗多糖加40倍0.3mol/LNaOH溶液，70℃加熱攪拌提取2h，加鹽酸中和，過濾，濾液濃縮，加入無水乙醇至67%，4℃靜置過夜，4500r/min離心20min，80%乙醇洗滌3次，沉淀減壓干燥，得83g莼菜粗多糖。除去脂
3、溶性成分取250g莼菜噴干粉，加無水乙醇2.5L，60℃旋轉(zhuǎn)回流提取2h，過濾，重復(fù)操作1次，除去脂溶性成分，濾渣烘干。莼菜噴干粉新鮮莼菜嫩葉，經(jīng)清水淋洗、均漿機剪切、噴霧干燥得莼菜噴干粉。粗多糖純化01020304酶解滅活脫蛋白粗多糖用2.5L純化水復(fù)溶，加入木瓜蛋白酶，63℃酶解6h，滅活過濾除去不溶物，濾液進行第2次酶解滅活脫蛋白。聚酰胺層析濾液流經(jīng)預(yù)處理的聚酰胺層析柱脫色，濾液與聚酰胺濕填料的體積之比為1∶1，純化水洗脫，共收集洗脫液8L。濾膜過濾濃縮再用微孔濾膜過濾，濾液用超濾膜超濾濃縮至800mL后加入無水乙醇至67%，4℃靜置過夜后離心，80%乙醇洗滌3次，減壓干
4、燥。得到BSP獲得灰白色膠狀莼菜多糖(BSP)22g，收率為8.8%。BSP含有量測定010203葡萄糖標準曲線制作BSP純度測定精密稱取干燥至恒重的BSP24.72mg至500mL量瓶，純化水溶解并定容，搖勻，測定樣品吸光度為0.521，計算可知BSP的純度為61.89%。紫外檢測粗多糖經(jīng)木瓜蛋白酶脫蛋白、聚酰胺脫色素等處理后，紫外全波長掃描顯示在260、280nm處其吸光度接近于零，表明已除去蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)。利用蒽酮硫酸法：以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(A)得曲線方程A=17.294X－0.0076(Ｒ2=0.9994)。BSP精制取10gBSP，20
5、0mL純化水充分溶解后過DEDA纖維素DE-52離子交換柱(60mm×950mm)，依次用0～1.0mol/LNaCl溶液梯度洗脫，分管收集洗脫液，采用“2.2”項下方法，以洗脫管數(shù)為橫坐標，多糖濃度為縱坐標繪制洗脫曲線。BSP經(jīng)DEAE纖維素DE-52分離后，可得3個峰(圖1)，透析(截留分子量8000～14000)、濃縮、凍干各峰組分，得到BSP-1、BSP-2、BSP-3。BSP精制對2個主要組分BSP-1、BSP-3用瓊脂糖凝膠柱SepharoseCL-6B進一步的分離純化，用純化水洗脫，蒽酮-硫酸顯色法測定多糖含有量。洗脫曲線(圖2)表明，莼菜精制多糖BSP-1、BS
6、P-3組分均一，分別濃縮、凍干。分子量測定色譜條件:色譜柱TSKgelG5000PWxl(10)、G4000PWxl(10)、G3000PWxl(7)(7.8mm×300mm)串聯(lián);保護柱TSKPWxlGuardcolumn;Agilent1260示差折光檢測器;流動相為純化水;體積流量0.4mL/min;進樣量30μL;柱溫30℃;檢測器溫度35℃;環(huán)境溫度25℃。稱取葡聚糖對照品、莼菜多糖各組分樣品（BSP1、BSP2、BSP3），分別用純水溶解并配制成2mg/mL的溶液，過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，將圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入GPC軟件，建立分子量分布標準曲線，得到分子量對數(shù)lo
7、gMW與洗脫體積VR的線性回歸方程logMW=10.513－0.2377VＲ(r=0.9962)，將莼菜多糖各組分導(dǎo)入GPC軟件，調(diào)用標準曲線，得出莼菜多糖各組分的Mw、Mn和D等，結(jié)果見表1，莼菜多糖的分子量分布為(1.0507～1.5208)×106Da，分子量較大。圖3顯示，高效凝膠滲透色譜圖出峰時間單一，可知莼菜多糖各組分均一性良好。感謝在座各位聆聽
