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《秀麗線蟲的研究和飼養(yǎng).ppt》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、秀麗隱桿線蟲的飼養(yǎng)及研究用途By王傳杰介紹秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans),屬于線形動物門、線蟲綱。體形非常小,成蟲只有1mm左右。線蟲是細胞定數(shù)動物,兩性成蟲只有959個體細胞,雄性成蟲只有1031個體細胞,其中131個細胞注定要接一定的發(fā)育程序陸續(xù)死亡。神經(jīng)系統(tǒng)解剖結構十分簡單,僅有302個細胞,約占整個動物體細胞總數(shù)的三分之一。它身體透明,能感知氣味和味道,對光線、溫度有反應。研究者很容易在顯微鏡下對其細胞和組織進行跟蹤觀察飼養(yǎng)與凍存設備試劑:大腸桿菌OP50——大腸桿菌OP50是尿嘧啶滲漏突變型,作為秀麗隱
2、桿線蟲的食物。NGM培養(yǎng)基——1000ml的NGM培養(yǎng)基內加有:3gNaCl,2.5g蛋白胨,17g瓊脂,1mol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH=6.0)25ml,975ml蒸餾水,滅菌后加入分別抽濾除菌的1ml膽固醇溶液(5mg/ml乙醇),1mol/LMgSO41ml,1mol/L的CaCl21mlM9緩沖液——每升緩沖液中含15.12gNa2HPO4#12H2O(或6gNa2HPO4),3gKH2PO4,5gNaCl,0.25gMgSO4#7H2O,宜現(xiàn)用現(xiàn)配S緩沖液——0.1mol/LNaCl,0.05mmol/LK2H
3、PO4-KH2PO4緩沖液(pH=6.0)喂養(yǎng)方法用冰M9緩沖液清洗蟲體置4℃環(huán)境20min1000r離心,棄上清,沉淀物用M9緩沖液重懸置4℃環(huán)境20min棄上清取200ul沉淀物以靠接法接種到涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上將培養(yǎng)基放置到16℃生化培養(yǎng)箱中,72h后可繁育至第二代凍存準備1mlEP管,加入700ul30%甘油(s緩沖液溶解)用冰M9緩沖液清洗蟲體置4℃環(huán)境20min,1000r離心棄去上清將蟲體轉入事先準備好的EP管中,置于-80℃冰箱凍存(可保存2個月),需要時取出室溫解凍重置培養(yǎng)基研究方法及用途研究范圍細胞程序性
4、死亡的遺傳調控機制RNAi及其作用機制秀麗線蟲的功能基因組學及其他研究低氧應答模式生物基因組學和功能蛋白組學的研究其他(MAPK信號傳導、TGF-b信號傳遞途徑、衰老和年齡及脂肪代謝等)方法——線蟲基因顯微注射顯微注射技術是線蟲研究領域的常用技術,對線蟲進行轉基因操作的一種高效且相對簡單的方法,主要用于研究線蟲突變種系的功能恢復(mutantrescue)、特定基因的過表達或異位表達、標簽蛋白的表達、特定蛋白質結構域的功能、DNA或RNA調節(jié)元件的分析及RNA干擾等.此外,這項轉基因技術對于特異表型的篩選也是個強有力的工具,并且它還可用于將
5、人工合成mRNAs或其他分子接引入細胞設備顯微注射全套儀器瓊脂糖固定墊添加了4%葡萄糖(glucose)的M9緩沖液注射步驟制劑及破針固定蟲將純化的DNA溶解在Tris-EDTA(TE)緩沖液中即可接用于注射。在注射液中加入終濃度約10mg/L的線蟲基因組DNA,則會有效地提高轉基因效率。將一小玻片放在加了注射油的固定墊上,操縱微操使注射針與玻片邊緣相撞,若針頭尖端撞破,可觀察到有液泡自動滲出注射時將線蟲挑至瓊脂糖固定墊上,調整線蟲使性腺暴露,滴加注射油覆蓋整個蟲體.固定好后的操作要迅速,否則線蟲容易脫水而死.將瓊脂糖固定墊放在載物臺上,4
6、0x物鏡下找到線蟲,使性腺聚焦在正確的平面.操作微操或輕移滑動載物臺,將注射針尖刺入性腺.啟動微量加壓器進行注射,能觀察到注射液在性腺中快速流動,注射后的性腺被液體充滿.在體視顯微鏡下,滴加恢復緩沖液至注射后的線蟲正上方,由于與油互不相溶,緩沖液會滲入油下使線蟲浮起.一般等待2~5min,線蟲活力恢復,身體開始游動,即可挑至培養(yǎng)板上,20℃常規(guī)培養(yǎng).注射恢復瓊脂糖固定墊取約50ul加熱溶解的2%瓊脂糖(agarose)溶液滴在長寬50mmx24mm,厚0.13~0.17mm的載玻片上,用另一載玻片輕壓其上,待瓊脂糖凝固后(約2min),將上
7、面的玻片從側面滑下即可.制作好的固定墊室溫過夜或65℃干燥1h后可疊放起來備用恢復緩沖液5.8gNa2HPO4,3.0gKH2PO4,0.5gNaCl,1.0gNH4Cl加水至1L,高壓滅菌,用于注射后線蟲的恢復注射子代目的基因表達檢測注射后約3天,觀察孵出的F1代是否有目的DNA表達.目前,線蟲外源基因表達的標記通常用:a.熒光蛋白與目的蛋白形成融合蛋白,但需要確定熒光蛋白的連接不影響目的蛋白的功能;b.目的基因與熒光標記基因共注射;c.目的基因與具有明顯表型的標記基因共注射,我們通常使用易觀察的pmyo-3::TDimerII作為熒光標
8、記,它在所有體壁肌肉細胞表達,轉基因效率高且本身對線蟲的行為和功能沒有影響。顯微注射后的整合目前常用的整合方法有:用y射線和X射線照射,或用光敏劑補骨脂素加長波紫外線照射整合(T