蛋白質的表達、分離、純化和鑒定.doc

《蛋白質的表達、分離、純化和鑒定.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。

1、蛋白質的表達、分離、純化和鑒定第一部分蛋白質的表達、分離、純化2、目的要求（1）了解克隆基因表達的方法和意義。（2）了解重組蛋白親和層析分離純化的方法。2、實驗原理克降基因在細胞中表達對理論研究和實驗應用都具有重要的意義。通過表達能探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理，同吋克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能的研究。大腸桿菌是冃前應用最廣泛的蛋白質表達系統(tǒng)，其表達外源基因產物的水平遠高于其它基因表達系統(tǒng)，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的80%。本實驗中，攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL21中，在37°C,IPTG（異丙基?D?硫代半乳糖昔）

2、誘導下，超量表達攜帶冇6個連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素?；D移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸（NTA）使銀離子（Ni2+）固相化的層析介質加以提純，實為金屬熬合親和層析（MCAC）O蛋白質的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。3、試劑和器材一、試劑[1]LB液體培養(yǎng)基：Trytone10g,yeastextract5g,NaCI10g,用蒸憾水配至lOOOmL.[2]氨節(jié)青霉素：100mg/mL[3]上樣緩沖液：100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,10mM2-ME,pH8.0[4]WashingBuffer：100mMNaH

3、2PO4,10mMTris,8MUrea,pH6.3[5]ElutionBuffer:100mMNaH2PO4,10mMTris,8MUrea,500mMImidazole,pH8.0[6]IPTG二、器材搖床，離心機，層析柱（V10cm）4、操作方法一、氯霉素?；D移酶重組蛋白的誘導1.接種含冇重組氯霉素酰基轉移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5mLLB液體培養(yǎng)基中（含100ug/mL氨節(jié)青霉素），37°C震蕩培養(yǎng)過夜。2.轉接ImL過夜培養(yǎng)物于100mL（含100ug/mL氨節(jié)青霉素）LB液體培養(yǎng)基中,37°C震蕩培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8。取10ul樣品用于

4、SDS-PAGE分析。3.加入IPTG至終濃度0.5mmol/l37°C繼續(xù)培養(yǎng)l-3h.4.12,OOOrpm離心10min,棄上清，菌體沉淀保存于?20°C或?70"C冰箱中。二、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的分離，純化1.NTA層析柱的準備:在層析柱屮加入ImLNTA介質，并分別用去離子水，8mL上樣緩沖液洗滌。2.重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，加入5mL上樣緩沖液，用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品60min,4°C12000rpm離心30min,將上清吸至一個干凈的容器屮，并棄沉淀。取:LOul上清樣品用于SDS-PAGE分析。

5、3.上清樣品以10-15mL/h流速上Ni2+?NTA柱，收集流出液，取10ul樣品用于SDS-PAGE分析。4.洗脫雜蛋白：用WashingBuffer以10-15mL/h流速洗柱，直至OD280=0.01.分步收集洗脫液，約取10ul洗脫開始時的樣品用于SDS-PAGE分析。5.洗脫目標蛋白：用ElutionBuffer洗柱，收集每1mL級分，分別取10ul樣品用于SDS-PAGE分析。第二部分蛋白質的鑒定K目的要求（1）了解SDS■聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗原理。（2）掌握凝膠電泳實驗操作規(guī)程。2、實驗原理電泳可用于分離復雜的蛋白質混合物，研究蛋白質的亞基組成等。在

6、聚丙烯酰胺凝膠電泳屮，凝膠的孔徑，蛋白質的電荷，大小，性質等因素共同決定了蛋白質的電泳遷移率。蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。但如果加入某種試劑使電荷因素消除，則電泳遷移率就取決于分子的大小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。十二烷基硫酸鈉（SDS）就具有這種作用。在蛋白質溶液中加入足夠量SDS和疏基乙醇，SDS可使蛋白質分子中的二硫鍵還原，蛋白質一SDS復合物帶上相同密度的負電荷，并可引起蛋白質構象改變，使蛋白質在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小,因此聚丙烯酰胺凝膠電泳可

7、以用于測定蛋白質的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)系統(tǒng)屮進行，其電泳漕緩沖液的pH值與離子強度不同于配膠緩沖液。該凝膠包括積層膠和分離膠兩部分。當兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動界面，并帶動加入凝膠的樣品中的SDS多肽復合物向前推進。樣品通過高度多孔性的積層膠后，復合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶(或稱積層)。由于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品屮的復合物全部濃縮于極小體積的能力，從而大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率，使蛋白依各自的大小得到分離。3、試劑和器材一、試劑[1]30%Acr-Bis貯存液：30gAcr,0.8gBis,用無