細(xì)胞各種染色方法.doc

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1、細(xì)胞培養(yǎng)后，需要對(duì)其生長情況、形態(tài)甚至生物學(xué)性狀進(jìn)行連續(xù)地觀察。由于細(xì)胞小而復(fù)雜，若不借助適當(dāng)?shù)氖侄危瑒t難以觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu)，更難發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)各種組分的分子組成及功能。目前，已有多種研究細(xì)胞的技術(shù)，從光鏡到電子顯微鏡，從一般細(xì)胞化學(xué)法到免疫化學(xué)法，本章將重點(diǎn)介紹一些常用的觀察和檢測(cè)方法?！　　　〉谝还?jié)培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查和觀察方法　　　　細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中需要每天進(jìn)行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察，及時(shí)了解細(xì)胞生長狀態(tài)、數(shù)量改變、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞有無移動(dòng)、有無污染、培養(yǎng)液pH是否變酸、變黃是否更換等。細(xì)胞常規(guī)檢查觀察的內(nèi)容為：　　一、肉眼觀察　　一般常規(guī)檢查用肉眼即可

2、觀察，主要看培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化。正常情況下，培養(yǎng)液pH介于7.2～7.4之間，呈桃紅色清亮透明。加入細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中置一般溫箱培養(yǎng)時(shí)，隨著細(xì)胞生長時(shí)間的延長，細(xì)胞代謝產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物會(huì)使培養(yǎng)液pH值下降，引起顏色變淺變黃。在超越緩沖范圍后培養(yǎng)液酸化變黃，如不及時(shí)調(diào)節(jié)pH，會(huì)影響細(xì)胞的生長，甚至造成細(xì)胞退變死亡。所以，一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃，應(yīng)及時(shí)換液傳代。一般更換培養(yǎng)液的時(shí)間，依營養(yǎng)物的消耗而定，正常情況生長穩(wěn)定的細(xì)胞2～3天換液一次，生長緩慢的細(xì)胞3～4天換液一次。培養(yǎng)液中加Hepes或用5%CO2溫箱培養(yǎng)可使pH維持穩(wěn)定，利于細(xì)胞生長。用含磷酸鹽緩沖

3、系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)，可因瓶及塞子漏氣，CO2溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶塞洗刷不潔、殘留堿性物，使培養(yǎng)液變堿發(fā)紅，只致使細(xì)胞難以生長，甚至死亡。細(xì)胞換液傳代后，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液很快變黃，要注意是否有細(xì)菌污染或培養(yǎng)器皿沒有洗干凈。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)若出現(xiàn)混濁，多為污染。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，應(yīng)將瓶豎起靜置1小時(shí)，若培養(yǎng)基混濁示為污染，也可在顯微鏡下仔細(xì)觀察有無污染現(xiàn)象出現(xiàn)。　　二、顯微鏡觀察　　生長良好的細(xì)胞，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。相差顯微鏡觀察時(shí)可見細(xì)胞部分細(xì)微結(jié)構(gòu)。若細(xì)胞生長狀態(tài)不良，可見細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)?，?xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆

4、粒狀物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落，有時(shí)細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。若細(xì)胞營養(yǎng)不良狀況沒有得到及時(shí)糾正，進(jìn)一步發(fā)展可見到部分細(xì)胞死亡，崩解漂浮在培養(yǎng)液中。發(fā)現(xiàn)這種情況應(yīng)及時(shí)處理，只有生長良好的細(xì)胞才能進(jìn)行傳代培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)研究。　　三、細(xì)胞的生長狀態(tài)　　細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)初代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)，都有一長短不同的潛伏期，在培養(yǎng)過程中注意觀察細(xì)胞增殖生長的狀態(tài)極為重要。各種細(xì)胞增殖的時(shí)間不盡一致。傳代細(xì)胞系，胚胎組織或幼體細(xì)胞潛伏期短，一般在接種培養(yǎng)第二天即可見細(xì)胞生長增殖，3～4天便可連接成片。成體組織的潛伏期長，老年組織

5、和癌組織潛伏期更長，可達(dá)一周左右。原代細(xì)胞培養(yǎng)中最先可見從組織塊中邊緣“長出”細(xì)胞，這種細(xì)胞是從原代組織塊中游走出來的，并不是細(xì)胞增殖產(chǎn)生。這種早期游出的細(xì)胞多以成纖維細(xì)胞為主，其易生長，適應(yīng)性強(qiáng)，呈放射狀或旋渦狀分布，很快生長并互相連接成網(wǎng)狀。傳代細(xì)胞在傳代后，一般經(jīng)過懸浮、貼壁伸展很快進(jìn)入潛伏期，對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞大量繁殖，逐漸相連成片而長滿瓶底。一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞長滿瓶底80%就應(yīng)及時(shí)傳代，否則會(huì)影響細(xì)胞生長甚至脫落。懸浮細(xì)胞當(dāng)發(fā)現(xiàn)生長顯著、密度增大、分布稠密、培養(yǎng)液變黃時(shí)也應(yīng)及時(shí)傳代?！　∷摹⑽⑸镂廴尽　〖?xì)胞接種、傳代、換液加藥后應(yīng)經(jīng)常觀察，密切注意是

6、否有微生物污染發(fā)生。一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液混濁、液體內(nèi)漂浮著菌絲或細(xì)菌，或生長明顯變緩，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，有中毒表現(xiàn)等應(yīng)懷疑是否有微生物污染，進(jìn)一步觀察檢查并及時(shí)處理。　　　　第二節(jié)培養(yǎng)活細(xì)胞的觀察方法　　　　培養(yǎng)活細(xì)胞可用相差顯微鏡直接觀察，也可用縮時(shí)攝影直接記錄活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，還可將離體活細(xì)胞染色?！　∫?、相差顯微鏡直接觀察法　　活細(xì)胞對(duì)光線是透明的，光線通過活細(xì)胞時(shí)，波長和振幅幾乎沒有改變，所以用普通光鏡無法看清未經(jīng)染色的活細(xì)胞。為了觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，則需要通過其他途徑提高結(jié)構(gòu)的反差。本世紀(jì)30年代，荷蘭物理學(xué)家Zernike設(shè)計(jì)的相差顯微鏡(Phasec

7、ontrastmicroscope)利用光的衍射和干涉特性，把透過標(biāo)本不同區(qū)域的光波的光程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對(duì)比，從而成功地解決了生物學(xué)上的大難題?！　∠嗖铒@微鏡由相差聚光器和相差接物鏡兩個(gè)主要部分組成。它與普通光鏡相比多了兩個(gè)部件，一個(gè)是在聚光器上增加一個(gè)環(huán)形光闌，使透過聚光器的光線形成空心光錐、聚焦到標(biāo)本上。另一個(gè)是在物鏡的后焦面增加一個(gè)相板，相板有一個(gè)環(huán)形區(qū)，其大小恰好通過環(huán)形光闌束的直射光，相板各區(qū)鍍以不同物質(zhì)，使得通過環(huán)形區(qū)的光比通過相板其他部位的光超前或滯后1/4λ。　　相差顯微鏡的基本原理是：把透過標(biāo)本的

8、可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)之間的對(duì)比度，使標(biāo)本的各種結(jié)構(gòu)變得更