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《DB22∕T 2812-2017 番茄細菌性潰瘍病病原檢測 LAMP法.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS65.020B05備案號：59176-2018DB22吉林省地方標準本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印DB22/T2812—2017番茄細菌性潰瘍病病原檢測LAMP法Detectionforbacterialcankeroftomatopathogen—LAMPmethod本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印2017-12-11發(fā)布2018-04-01實施吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印DB22/T2812—2017本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印前言本標準按照GB/T1.1—2009和GB/T20001.4—2015給出
2、的規(guī)則起草。本標準由吉林省農(nóng)業(yè)委員會提出并歸口。本標準起草單位：吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院。本標準主要起草人：毛芙蓉、王利波、劉燕妮、鄭士金、李欣敏、潘博、鄭建超、王劍鋒、婁琦、王志琴。本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印I本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印DB22/T2812—2017本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印番茄細菌性潰瘍病病原檢測LAMP法1范圍本標準規(guī)定了番茄細菌性潰瘍病病原LAMP檢測的原理、試驗條件、試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗步驟、試驗結(jié)果觀察、質(zhì)量保證和控制、試驗報告。本標準適用于番茄種苗、植株和果實中番茄細菌性潰瘍病病原
3、的定性快速檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測NY/T2286番茄潰瘍病菌檢疫檢測與鑒定方法3術(shù)語和定義本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1番茄細菌性潰瘍病bacterialcankeroftomato由密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種（Clavibactermichiganensissubsp
4、.michiganensis）引起的一種維管束病害，從番茄苗期到收獲期均可發(fā)病。該病害病原的分類地位、寄主范圍、地理分布、危害癥狀及傳播途徑參見附錄A。3.2環(huán)介導(dǎo)等溫擴增loop-mediatedisothermalamplification(LAMP)LAMP是一種新型的核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，在BstDNA聚合酶作用下，以特異性引物為延伸起點，在60℃～65℃恒溫條件下通過鏈置換反應(yīng)進行的DNA擴增方法，擴增產(chǎn)物是一系列復(fù)雜的大小不等的DNA混合物。4原理4.1一般原理根據(jù)番茄細菌性潰瘍病原的特異性基因to
5、mA的核苷酸序列（GenBank登錄號為HE861510），設(shè)計LAMP內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物各一對，特異識別tomA基因的六個獨立區(qū)域。在反應(yīng)溶液中加入含有靶標核苷酸序列的DNA，在BstDNA聚合酶的作用下啟動鏈置換反應(yīng)，生成莖環(huán)DNA混合物。擴增反應(yīng)結(jié)束后加入SYBRGreenI熒光染料，即可通過產(chǎn)物雙鏈DNA與染料結(jié)合后顏色變化，觀察判定結(jié)果。1DB22/T2812—20174.2顯色原理SYBRGreenI是一種高靈敏度的DNA熒光染料，可以嵌入方式結(jié)合到雙鏈DNA的小溝內(nèi)。當(dāng)它與雙鏈DNA結(jié)合時，熒光信號是游離狀態(tài)的800～1本標準僅供
6、內(nèi)部使用不得翻印000倍。在不發(fā)生擴增反應(yīng)時，SYBR染料分子的熒光信號不發(fā)生改變，顏色顯現(xiàn)為橙色；當(dāng)發(fā)生擴增反應(yīng)時，隨著雙鏈DNA的增加，SYBR染料的熒光信號也隨之大幅度增強，其信號強度可代表雙鏈DNA分子的數(shù)量，同時顏色由橙色變成綠色。5試驗條件常規(guī)實驗室條件。6試劑或材料6.1LAMP引物，包括外引物1、外引物2、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、環(huán)引物1和環(huán)引物2，其核苷酸序列分別為：——外引物1：5’-CGCTGGGCTTGACCGA-3’——外引物2：5’-CCCACCGATCGATCCTTCC-3’——內(nèi)引物1：5’-TACTCCGGATCGCA
7、GCAGCTAGAGCACGACATGGCGG-3’——內(nèi)引物2：5’-CGTGACCTCGATCACGGATGCGTAACGCTCCATCACAGTGG-3’——本標準僅供內(nèi)部使用不得翻印環(huán)引物1：5’-GGAGATCAGACCATGGCCCTTTA-3’——環(huán)引物2：5’-GCGGCGATGACAGAGCA-3’注：引物純度以HPLC級為宜。6.2引物混合溶液：配制6.1中所列引物混合溶液，外引物1、外引物2、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、環(huán)引物1和環(huán)引物2的濃度依次為5μmol/L、5μmol/L、40μmol/L、40μmol/L、5μmol/L和5
8、μmol/L。6.3BstDNA聚合酶：濃度為8U/μL。6.410×LAMP反應(yīng)緩沖液：含200mmol/LTris-H
