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1、第十二章制備型高效液相色譜在生物制藥中的應(yīng)用基因工程藥物:白細(xì)胞介素、胰島素。天然產(chǎn)物:蛋白質(zhì),多肽,多糖。第一節(jié)高效液相色譜法簡介液相色譜的發(fā)展史1903年，色譜法問世 俄國植物學(xué)家茨維特1903年3月21日，大會(huì)報(bào)告“一種新型吸附現(xiàn)象及其在生化分析上的應(yīng)用”1906年在德國植物學(xué)雜志發(fā)表文章，首次命名上述分離后色帶為色譜圖，稱此方法為色譜法1931年，庫恩（Kuhn）分離胡蘿卜素，1938年，Kuhn和Lederer從維生素B中分離出B6，獲得了1938年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1941年，馬?。∕artin）和辛格（Synge）提出液液分配色譜法，1952年度的諾貝爾獎(jiǎng)。60年代末，70年代初，
2、高效液相色譜儀的成功研制1.2基本儀器裝置輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2.1高效液相色譜儀組成1輸液系統(tǒng)(1)高壓輸液泵作用：將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。高壓輸液泵在線脫氣裝置(1)高壓輸液泵(2)在線脫氣裝置作用：脫去流動(dòng)相中的溶解氣體。流動(dòng)相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱。在線脫氣、超聲脫氣、真空脫氣等脫氣不好時(shí)有氣泡，導(dǎo)致流動(dòng)相流速不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加。PressureDampersO2,N2,CO2…（3）梯度洗脫裝置Isocraticelution恒定組成的單一溶劑體系Gradientelutio
3、n以一定速度改變多種溶劑的配比淋洗，目的是分離多組容量因子相差較大的組分High-PressureMixing2進(jìn)樣系統(tǒng)六通閥3色譜柱Normalcolumn5-?m、4.6-?mNarrowborecolumn1-3?mMicrocolumn<1?m色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件。要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。色譜柱填料sphericalandirregularsilicaparticlesMacroporoussphericalsilicaparticle.[K.K.Unger,Poroussilica,Elsevier,1979]基質(zhì)：載體
4、或擔(dān)體。數(shù)?m~數(shù)十?m，球形。硅膠或有機(jī)高分子聚合物PellicularparticlePorousparticle30-50?m1-2?m3-10?m色譜柱填料功能層：物理吸附或化學(xué)鍵合三、高效液相色譜法的特點(diǎn)采用高效色譜柱、高壓輸液設(shè)備和高靈敏度檢測器,從而實(shí)現(xiàn)了高效、高速、高靈敏度和定量準(zhǔn)確。和經(jīng)典液相相比有以下優(yōu)點(diǎn)：快速、靈敏度高、分辨率高、自動(dòng)化程度高等。四、制備型高效液相色譜與分析型 高效液相色譜法的區(qū)別流速不同檢測池不同上樣量不同色譜柱不同五、色譜的基本理論及有關(guān)參數(shù)兩大理論：塔板理論(theplatemodel):闡明了色譜、蒸餾和萃取之間的相似性，將色譜柱設(shè)想成由許多液液萃
5、取單元或理論塔板組成；相似于精餾過程，色譜分離也是一個(gè)分配平衡過程.N=16(tR/wb)2N=5.54(tR/w1/2)2速率理論:研究各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬的影響。H=A+Cu有關(guān)參數(shù)分離度：在色譜過程中表示兩組分相互分離的程度,一般情況下,分離度大于1.5時(shí)稱分離完全.只有峰窄而間距大的分離是令人滿意的。在色譜分析中要求：兩組分的保留值差別要足夠大。兩色譜峰要足夠窄。待測組分的分離度要足夠大，分離過程要盡可能短.容量因子：溶質(zhì)在固定相中的總摩爾數(shù)與流動(dòng)相中總摩爾數(shù)之比。選擇因子：兩組分容量因子的比值容量因子、選擇因子、理論塔板數(shù)對(duì)分離度的影響六、制備型高效液相色譜的重要參數(shù)Capacit
6、y:純化過程中，目標(biāo)物質(zhì)的上樣量?？梢允求w積也可以是質(zhì)量。Speed:在除去蛋白酶的過程中此項(xiàng)非常關(guān)鍵。Recovery:產(chǎn)品貴重時(shí)此項(xiàng)很重要。流動(dòng)相的條件、環(huán)境會(huì)影響它。減少步鄹和保持一種對(duì)生物樣品合適的環(huán)境條件。Resolution:在純化的最后階段，此項(xiàng)很關(guān)鍵，尤其是雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和目的物結(jié)構(gòu)相似時(shí)。七、分離機(jī)理和色譜類型分離蛋白質(zhì)類物質(zhì)時(shí)的分離依據(jù)：疏水性分子大小等電點(diǎn)結(jié)構(gòu)特異性色譜介質(zhì)按分離機(jī)理分為正相色譜反相色譜：常加入TFA離子交換色譜：陰離子交換色譜（DEAE二乙基氨基乙基，Q季胺鹽）陽離子交換色譜（CM羧甲基S磺酸基）凝膠過濾色譜疏水色譜：苯基，辛基等。金屬螯合色譜：鎳、銅等親合
7、色譜第二節(jié)分離方案的設(shè)計(jì)Whatistheintendeduseoftheproduct?Whatkindofstartingmaterialisavailableandhowshoulditbehandled?Whatarethepurityissuesinrelationtothesourcematerialandintendeduseofthefinalproduct?Whathastobe
