實驗三革蘭氏染色實驗課件.ppt

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1、實驗三革蘭氏染色法河南城建學院環(huán)境科學與工程實驗中心環(huán)境生物技術實驗室一目的要求：1、學習并初步掌握革蘭氏染色法。2、了解革蘭氏染色法的原理極其在細菌分類鑒定中的重要性。二基本原理：革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家ChristainGran創(chuàng)立的，基本步驟是：1、初染：結晶紫染色2、媒染：碘液媒染3、脫色：乙醇脫色4、復染：番紅復染經(jīng)此法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；細胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復染劑的顏色（紅色）的細菌為革蘭氏陰性菌。GramstainofGram-GramstainofG

2、ram+實驗原理：細菌對革蘭氏染色的不同反應是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。初染后，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結晶紫結合成結晶紫—碘的復合物，增強染料與細菌的結合力。當用脫色劑處理時，革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結構組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇脫色時細胞壁脫水，使肽聚糖層的網(wǎng)狀結構孔經(jīng)縮小，透性降低，從而使結晶紫—碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂質(zhì)含量高，所以當脫色處理時，類脂

3、質(zhì)被乙醇溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫—碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。StructureofaGram-NegativeCellWallStructureofaGram-PositiveCellWall三、器材：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，革蘭氏染色液，載玻片，顯微鏡等四、操作步驟：1、涂片：將大腸桿菌（24h）和金黃色葡萄球菌（24h）分別涂片、干燥、固定。2、染色：（1）初染：加草酸銨結晶紫一滴，約一分鐘，水洗（2）媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋一分鐘，水洗（3）脫色：將水甩凈

4、，并襯以白背景，用95%乙醇滴洗至剛剛無紫色為止，約20—30秒，立即用水沖凈乙醇（4）復染：用番紅液染1--2分鐘，水洗3、鏡檢：干燥后，油鏡觀察。以分散開的細菌顏色為準，革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。4、混合制片觀察：一載玻片上兩種菌混合制片，對比觀察。步驟1：涂片步驟2：干燥步驟四染色步驟三固定crystalvioletstainwashwithwater結晶紫染色水洗Stainwithgram'siodinesolution碘液復染Decolorizebyadding95%alcohol95%酒精脫色

5、CounterstainwithSafranin沙黃復染Resultsofstain染色結果五注意事項1）注意涂片不宜過。2）火焰固定溫度要適宜。3）注意控制好脫色程度。六、實驗報告：1、結果：列表簡述2株細菌的染色觀察結果（形狀、顏色、革蘭氏染色反應）。2、思考題：1）作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關鍵步驟是什么？2）當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術操作正確，結果可靠？3）造成革蘭氏染色結果不正確（假陰性或假陽性）的主要原因有哪些？