產(chǎn)殼聚糖酶的腸桿菌分離鑒定及其培養(yǎng)特性研究

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1、魯東大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)LudongUniversityJournal(NaturalScienceEdition)2014，30(1)：43—47產(chǎn)殼聚糖酶的腸桿菌分離鑒定及其培養(yǎng)特性研究程仕偉，張盈，倪培拙，崔海洋，楊立紅，馬玉岳(1．魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264039；2．煙臺(tái)恒源生物股份有限公司，山東龍口265709)摘要：針對(duì)篩選的一株產(chǎn)殼聚糖酶菌株進(jìn)行了鑒定和培養(yǎng)特性研究．首先對(duì)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)、顯微鏡檢并結(jié)合生理生化與16SrDNA分子鑒定以確定菌屬來(lái)源，后對(duì)菌株產(chǎn)殼聚糖酶的碳源、氮源、金屬鹽和誘導(dǎo)物進(jìn)行篩選優(yōu)化．結(jié)果表明：

2、產(chǎn)酶菌株為產(chǎn)氣腸桿菌，最佳培養(yǎng)碳源為葡萄糖，最佳氮源為氯化銨和酵母粉，MnSO，MgSO，KC1和NaC1對(duì)產(chǎn)酶有積極作用．該菌來(lái)源的殼聚糖酶為誘導(dǎo)酶，最佳誘導(dǎo)物為粉末殼聚糖，殼聚糖酶活性為1．58U／mL．關(guān)鍵詞：分離鑒定；腸桿菌；殼聚糖酶；培養(yǎng)特性中圖分類(lèi)號(hào)：Q93文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1673．8020(2014)01—0043—05殼聚糖是由2一氨基-D-葡萄糖和2一乙酰氨基-D-葡萄糖通過(guò)13—1，4糖苷鍵連接而成的天1材料與方法然高分子多糖J，但是其水溶性較差，能溶于弱酸且粘度大，因此限制了其廣泛應(yīng)用J．殼聚糖1．1材料與試劑經(jīng)降解后得到的殼寡

3、糖與殼聚糖相比具有良好的水溶性，易被機(jī)體吸收，且具有許多獨(dú)特的生理活3，5一二硝基水楊酸購(gòu)自BBI公司，85％脫乙性_3J：可作為功能性食品添加劑和防腐劑；在酰度的殼聚糖購(gòu)自濟(jì)南海得貝生物工程有限公農(nóng)業(yè)上是良好植物調(diào)節(jié)和生物防治劑，可開(kāi)發(fā)為司，其余試劑均為分析純或生物純．無(wú)公害的新型生物農(nóng)藥；在醫(yī)藥上可開(kāi)發(fā)成抗1．2儀器與設(shè)備癌、免疫系統(tǒng)藥物j．殼寡糖的制備可采用化學(xué)降解法、物理降解法和酶降解法J，與常用的化TU．1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通儀器；SW-CJ-1B超凈工作臺(tái)，蘇州安泰；H1850R學(xué)降解法相比，酶降解法生產(chǎn)殼寡糖的反應(yīng)條件溫和且易控

4、制，產(chǎn)品得率高、功能性強(qiáng)，不會(huì)造成離1、5"機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器；HZQ—Q全溫?fù)u床，環(huán)境污染，是殼寡糖制備的主要方法J．哈爾濱東聯(lián)；PCR擴(kuò)增儀，BBI公司；凝膠成像系殼聚糖酶(Chitosanase，EC3．2．1．132)是一統(tǒng)，GeneGenius公司．類(lèi)可催化殼聚糖的13—1，4一糖苷鍵斷裂，專(zhuān)一性1．3菌株篩選降解底物制備殼寡糖的糖苷水解酶J，廣泛存在于細(xì)菌m]、放線菌[“]、真菌等微生物中．不同市售鮮蝦浸入無(wú)菌水中振蕩10min后，稀釋涂布以膠體殼聚糖為唯一碳氮源培養(yǎng)基上篩選，微生物來(lái)源殼聚糖酶催化特性存在差異，且因酶產(chǎn)生透明圈的為產(chǎn)殼聚糖酶

5、的微生物．篩選培養(yǎng)解作用模式不同造成產(chǎn)物殼寡糖聚合度不同．基(g／L)配方：酵母粉2，NH4C13，KHPO2，NaC1因此對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶的微生物菌株進(jìn)行廣泛篩選，8，MgSO1，膠體殼聚糖6，瓊脂2O，調(diào)pH5．8．選育出能夠適用不同聚合度產(chǎn)品合成的生物催化劑具有積極意義．本文從鮮蝦表面篩選的產(chǎn)殼聚1．4菌株鑒定糖酶菌株進(jìn)行了分離鑒定及培養(yǎng)條件研究，旨在觀察菌落形態(tài)，并經(jīng)簡(jiǎn)單染色、革蘭氏染色和為殼聚糖酶的微生物來(lái)源提供新途徑．芽胞染色后顯微鏡檢．菌株生理生化鑒定方法參收稿日期：2013—05-20；修回日期：2013—06-06基金項(xiàng)目：山東省高等學(xué)校科技計(jì)

6、劃項(xiàng)目(J12LD02)；魯東大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新基金(12y039)作者簡(jiǎn)介：程仕偉(1976一)，男，山東濰坊人。講師，博士，主要從事酶技術(shù)研究。E—mail：swbiotech@yeah．net。第1期程仕偉，等：產(chǎn)殼聚糖酶的腸桿菌分離鑒定及其培養(yǎng)特性研究45———————————0．001圖3基于16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表1生理生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果O．7o．6炔謹(jǐn)O．0123456789圖4碳源對(duì)菌株產(chǎn)殼聚糖酶的影響2．4氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響發(fā)酵培養(yǎng)基(L)：葡萄糖20，殼聚糖粉末1，不同氮源10(見(jiàn)圖5)，MgSO1，MnSO0．5，NaC13，KC13，

7、pH7．0．發(fā)酵培養(yǎng)條件：溫度30℃，轉(zhuǎn)速200r／min，接種量4％(v／v)，發(fā)酵培養(yǎng)36h．由圖5可以看出，氮源對(duì)菌株產(chǎn)殼聚糖酶的影響注：“一”為陰性，“+”陽(yáng)性順序分別為：NHC1>酵母粉>(NH)2SO>美藍(lán)染色后鏡檢觀察腸桿菌呈橢圓形，個(gè)體(NH4)2HPO4>NH4NO3>蛋白胨>牛肉膏>尿素>較小，革蘭氏陰性，未見(jiàn)芽孢形成．該菌株的生理大豆蛋白胨，其中NHC1為最佳氮源，在此條件生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定下殼聚糖酶活性為1．17U／mL．總體來(lái)說(shuō)，無(wú)機(jī)氮手冊(cè)》和《常用細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，其與產(chǎn)氣腸桿菌源對(duì)菌株產(chǎn)殼聚糖酶有利，從增

8、加殼聚糖酶產(chǎn)量的培養(yǎng)特征高度相似．綜合16SrDNA