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《CTAB法枯草芽孢桿菌(Bacillus-subtilis)基因組DNA的提取.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、CTAB法枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）基因組DNA的提取內(nèi)容提要以枯草芽孢桿菌為材料，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化銨）提取枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）的基因組DNA作為基因擴(kuò)增的模板，并測(cè)定其含量和純度。本實(shí)驗(yàn)要求：提取高質(zhì)量的基因組DNA為下一步的基因操作準(zhǔn)備。原理高純度、高分子量的基因組DNA是構(gòu)建基因組文庫(kù)、Southern雜交(包括RFLP)及PCR等后續(xù)的分子生物學(xué)操作的基礎(chǔ)。利用基因組DNA較長(zhǎng)的特性，可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中，可用玻棒
2、將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部，從而達(dá)到提取的目的。在提取過程中，染色體會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，因此分離基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量在溫和的條件下操作，如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩，以保證得到較長(zhǎng)的DNA。一般來說，構(gòu)建基因組文庫(kù)，初始DNA長(zhǎng)度必須在100kb以上，否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進(jìn)行RFLP和PCR分析,DNA長(zhǎng)度可短至50kb，在該長(zhǎng)度以上，可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段(20kb以下)，并可保證包含PCR所擴(kuò)增的片段(一般2kb以下)。不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同；不同種類或同
3、一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法,以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質(zhì)對(duì)隨后的酶切、PCR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用，因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時(shí),應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。DNA的含量與純度在研究工作中十分重要，常常需要測(cè)定。目前使用較多和較簡(jiǎn)便的是紫外吸收法。核酸在260nm波長(zhǎng)有一特征吸收峰，根據(jù)其光密度（OD）值可計(jì)算DNA濃度。蛋白質(zhì)在260nm波長(zhǎng)處有一特征吸收峰，在260nm處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低，因此當(dāng)核酸樣品中蛋白質(zhì)含量較低時(shí)，對(duì)核
4、酸的紫外測(cè)定影響不大。DNA的260nm與280nm吸收比值在1.8左右，當(dāng)制品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)此比值下降，比值大于2時(shí)表明RNA及核酸碎片多，比值在1.8-1.99表明純度較好。一、主要儀器、材料、和試劑1.儀器移液器，高速冷凍離心機(jī)，臺(tái)式離心機(jī)，水浴鍋，紫外可見分光光度計(jì)。2.實(shí)驗(yàn)材料枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）3.試劑⑴.CTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O，緩慢加入10gCTAB，加水至100ml。⑵.氯仿：異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70%乙醇，TE（10mMTris-HCl，1mMEDTA,
5、pH8.0），10%SDS，蛋白酶K(20mg/ml或粉劑)，5mol/LNaCl。二、操作步驟1.取100ml過夜培養(yǎng)的菌液，5000rpm離心10分鐘，棄上清液。2.菌體沉淀用10mlTE懸浮，并加0.5ml10%SDS，50μl蛋白酶K，混勻，37℃保溫1小時(shí)。3.加1.5ml5mol/LNaCl，混勻。再加1.5mlCTAB/NaCl溶液，混勻，65℃保溫20分鐘。4.用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提，5000rpm離心10分鐘，移取上清液至干凈離心管。5.用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干凈管中。6.加1倍體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止10
6、分鐘，10000rpm離心15分鐘得到DNA沉淀。7.加入700μl70%乙醇，70μl3MNaAc漂洗DNA沉淀，溶解于1mlTE，-20℃保存。8.去除RNA：加5μlRNase加1/10體積3MNaAc加2倍體積無水乙醇10分鐘后，將DNA沉淀溶于1mlTE，-20℃保存。9.用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性。10．用分光計(jì)測(cè)定濃度及純度：產(chǎn)品DNA溶液用TE緩沖液適當(dāng)稀釋后以TE調(diào)零，在260nm和280nm處分別測(cè)光密度OD值，計(jì)算DNA濃度（經(jīng)驗(yàn)公式ug/ml=OD260×50×稀釋倍數(shù)）以及含量、產(chǎn)率計(jì)算OD260/OD280比值，評(píng)價(jià)其純度。
