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《微陣列比較基因組雜交技術》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、萬方數據微陣列一比較基因i組豢蠢嘲翻麓鞠黼蠢鬃鬻腫瘤研究中的應博爹謄攀鬻薰蒸鬻戮鬻蒸鬻辮j。j?『．。管。i警毒鬻t鬻凌鬻毫豢i毫≥?！芊摇埚?一f．一B
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3、。囂魯i；§?！忠籵#·‘i。j?！皩O新房1，2綜述，王新保1，余傳定1審校(1．浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江杭州310022；2．浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州310053)ApplicationofArray——ComparativeGenomicHybridizationinCancerResearchSUNXin-fang,WANGXin-
4、6∞．YUChuan—ding摘要：微陣列比較基因組雜交(a咖y—CGH)技術是將DNA克隆或cDNAs做成微陣列，代替?zhèn)鹘yCGH法中中期染色體作為雜交靶，不僅使分辨率提高．甚至可以確定腫瘤相關基因并提供精確的定位。全文綜述Array—CGH的原理、方法及其在腫瘤學中的應用和意義。關鍵詞：微陣列一比較基因組：雜交：腫瘤中圖分類號：R329．2；R73—3文獻標識碼：A文章編號：1004—0242(2007)07—0525—04微陣列比較基因組雜交farray—comparativege．nomiehybridi
5、zation，Array—CGH)技術是將DNA克隆或cDNAs做成微陣列，代替?zhèn)鹘yCGH檢測中將中期染色體作為雜交靶進行檢測，不僅使分辨率提高，而且還可以確定腫瘤相關基因并提供精確的定位。同時可經計算機軟件識別每條染色體，克服了需要經驗豐富的人員識別染色體的限制．為快速全面地分析腫瘤組織DNA拷貝數的變化，以及染色體不穩(wěn)定性的檢測提供了較為理想的方法。本文就該技術原理、方法及其在腫瘤研究中的應用作一簡單的綜述。1微陣列一比較基因組雜交概述1．1Array—CGH基本原理Array—CGH與CGH相似，但它是用
6、DNA克隆或cDNAs微陣列代替中期染色體鋪片作為雜交靶．即將等量的不同熒光標記的待測和參照DNA經人Cot一1DNA封閉非特異性重復序列后，同時雜交到由DNA克隆或cDNAs組成的微陣列上。用微陣列每個靶點上的兩種信號的熒光比例反映待測基因組DNA在相應的序列或基因上的拷貝數變化【㈨。1．2方法1．2．1微陣列制備微陣列可以為DNA克隆微陣列和cDNAs微陣收稿日期：2006—06—20：修回日期：2007—06—08中國腫瘤2007年第16卷第7期列。DNA克隆是在BAC、PAC或YAC載體中克隆的DNA片
7、段。cDNAs微陣列，可以從樣本中提取總RNA，再分離mRNA，然后將得到的cDNAs進行PCR擴增。用專門的儀器將DNA克隆或cDNAs點樣至覆蓋特定介質的玻片上，按照在染色體中的分布，確定靶點的排列順序。為了得到精確的結果，每個靶點可重復點樣2～10次。點樣后，立即將玻片在80℃烘烤10min，制成微陣列玻片，存儲在帶有干燥劑的盒子里，室溫保存[1’z，蜘。1．2．2待測DNA和參照DNA制備及標記待測DNA可以來自腫瘤細胞系、冷凍或石蠟包埋的腫瘤組織。應盡可能選擇具有典型組織學特征的腫瘤細胞，棄除壞死組織
8、和炎癥區(qū)及周邊正常細胞，以免干擾。使用標準的酚一氯仿一異戊醇提取法分離腫瘤細胞和組織中的DNA。對于甲醛固定、石蠟包埋組織，可以用激光捕獲顯微切割法(LCM)獲得腫瘤組織，提取DNA．再用變性引物介導的PCR(DOP—PCR)擴增和標記[8]，參照DNA來源于健康人血液中的白細胞或同一患者同一器官中正常組織。對探針可以進行直接或間接熒光標記。標記方法有以下幾種：①缺口平移法；②隨機引物法；③DOP—PCR法；④順鉑一熒光素連接法[1，91等。標記完成后用SephadexG5旋轉柱去除未結合的核苷酸【1]。1．2
9、．3雜交將不同熒光標記的待測和參照DNA(各1¨q)525萬方數據與人Cot．1(60斗)混合，封閉非特異重復序列，降低本底作用。然后．q將待測和參照DNA80℃熱變性10min。37℃孵育1～2h，再與已經預熱的微陣列37℃雜交過夜，雜交后洗滌微陣列玻片，蓋上蓋玻片。對于DNA克隆微陣列，可以用DAPI復染。有助于定位靶克隆[1．2，鑭。1．2．4數據處理和圖像分析用共聚焦掃描裝置或帶有冷光源相機的光學設備獲取圖像，并用專門的分析軟件處理數據。需要確定實際的靶區(qū)域、靶信號強度和局部背景強度。從靶信號強度中扣除
10、局部背景得到靶熒光比例。將正常標本在微陣列全部靶點的平均熒光比例調整為1．代表無DNA拷貝數變化。利用全部靶點的平均熒光比例(M)和標準差(S)確定拷貝數變化的界限。獲得和缺失分別定義為>(M+2s)和<(M一2s)．高水平擴增定義為>(2M+2s)t7]。分析時去除在正常樣本中熒光信號不知的點(熒光信號高出背景<20％)和有過多熒光殘骸的點【8]。DNA拷貝數圖像可以用移動平均值(m
