rmp基因干擾對肝癌細(xì)胞周期的影響

《rmp基因干擾對肝癌細(xì)胞周期的影響》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、中國生物工程雜志ChinaBiotechnology，2011，31(5):8-14*RMP基因干擾對肝癌細(xì)胞周期的影響＊＊郭云蘭楊慧翠連曉寧曹鍇王曉婷仲蕾魏文祥(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院蘇州215123)摘要目的:建立RMP(RPB5-MediatingProtein)基因干擾的穩(wěn)定細(xì)胞株，研究RMP基因干擾對正常肝細(xì)胞及其肝癌細(xì)胞周期的影響。方法:構(gòu)建RMP基因的短發(fā)卡RNA(short-hairpinRNA，shRNA)真核表達載體pGPU6-Neo-RMPi-484。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染到SMMC-7721肝癌細(xì)

2、胞中，G418篩選出干擾RMP基因的細(xì)胞株;RT-PCR檢測RMP基因的表達;流式細(xì)胞儀PI染色檢測細(xì)胞周期;RT-PCR檢測周期相關(guān)基因的表達。結(jié)果:成功構(gòu)建pGPU6-Neo-RMPi真核表達載體，篩選出穩(wěn)定干擾細(xì)胞株，并且發(fā)現(xiàn)干擾RMP基因能夠明顯引起SMMC-7721肝癌細(xì)胞的G2/M期阻滯。結(jié)論:干擾RMP基因引起SMMC-7721肝癌細(xì)胞G2/M期阻滯，可能是通過下調(diào)G2/M期檢驗點相關(guān)基因CyclinB、P21和CDK1的表達實現(xiàn)的。關(guān)鍵詞干擾RMP肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期中圖分類號Q789RMP(RPB5-Mediatin

3、gProtein)是RNA聚合酶II基因的短發(fā)卡RNA(short-hairpinRNA，shRNA)真核表(RNApolymeraseII，RNAPII)第5亞基RPB5的調(diào)節(jié)蛋達載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染到SMMC-7721肝［1］白，RMP最早于1995年由Cheong等采用Far-癌細(xì)胞中，采用流式細(xì)胞儀PI染色檢測細(xì)胞周期，探討32RMP基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的細(xì)胞周期的影響。Western印記法，以P標(biāo)記的重組人RPB5探針從人肝［2-4］［5］癌細(xì)胞株的cDNA文庫中篩查得到。Christine等1材料與方法在對線蟲的研

4、究中發(fā)現(xiàn)RMP同源基因URI-1在線蟲細(xì)1．1材料胞周期的有絲分裂和減數(shù)分裂、精子和卵子的生成、生SMMC-7721肝癌細(xì)胞由本實驗室保存;E．coli殖細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié)、生育力以及種系生存力等多個環(huán)DH5α菌株、重組表達載體Nkcflag-RMP質(zhì)粒為本科室節(jié)起作用。URI-1的缺失可能導(dǎo)致DNA復(fù)制中斷，染保存;RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清購自Gibco公司;真色體缺陷以及DNA修復(fù)受損，三者共同導(dǎo)致內(nèi)源性核表達質(zhì)粒pGPU6-Neo-RMPi、pGPU6-Neo-SCRi的DNA損傷，從而引起細(xì)胞凋亡、細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分

5、［6］siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計并合成;BbsⅠ、HindⅢ和裂周期阻滯。這些研究結(jié)果表明RMP是一個重要BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自MBI公司;的轉(zhuǎn)錄因子，在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、基因組穩(wěn)定性的TaqDNA聚合酶購自Fermenant公司;DL2000marker維持以及在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起到重要作用。購自TaKaRa公司;日常型小量質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR因為RMP首先是在肝癌細(xì)胞中篩查得到的，已有產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自杭州維特潔研究顯示它可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展有著一定的關(guān)［2-4］生化技術(shù)有限

6、公司;陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000、系。目前對于RMP的研究大多圍繞在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)Trizol購自Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒、TaqDNA［2］節(jié)方面的作用，有關(guān)RMP基因在肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周聚合酶購自Fermenant公司;酵母提取物、胰蛋白胨、瓊期方面的研究尚未見文獻報道。研究通過構(gòu)建RMP脂粉等生化試劑購自上海生工生物技術(shù)有限公司;引收稿日期:2010-09-03修回日期:2010-10-18物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。*江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(BK2009121，BK2005028

7、)＊＊通訊作者，電子信箱:wenxiangw@suda．edu．cn2011，31(5)郭云蘭等:RMP基因干擾對肝癌細(xì)胞周期的影響91．2方法250μl，混勻，室溫孵育5分鐘。輕輕混合A、B兩液，室1．2．1載體構(gòu)建根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心溫放置30分鐘后補加500μl無血清RPMI1640培養(yǎng)基(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)數(shù)稀釋。轉(zhuǎn)染:用無血清RPMI1640漂洗六孔板中的細(xì)胞據(jù)庫中RMP基因(GenBank編號:NM134447)的cDNA2次。把轉(zhuǎn)染液

8、緩緩均勻的滴加入六孔板中，兩孔為堿基序列，設(shè)計針對RMP基因的最佳干擾序列si-RNAi實驗組，兩孔為陰性對照空質(zhì)粒組，兩孔為細(xì)胞RNA，為5'-GGAUUUGCUAGCUGAUAAATT-3'，經(jīng)對照組。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)6h后每孔補加