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1、山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名系年級(jí)學(xué)號(hào)日期科目遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)題目模式植物擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定模式植物擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定摘要：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞后，在獲得的后代分離群體中，有T-DNA插入的純合突變體，雜合突變體，和野生型。在突變體研究中，需要的材料是純合突變體。本次實(shí)驗(yàn)意在對(duì)模式植物擬南芥T-DNA插入突變體進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)中用到的主要實(shí)驗(yàn)方法有：CTAB法提取擬南芥基因組DNA、PCR擴(kuò)增目的基因片段、瓊脂糖凝膠電泳分離核酸。PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。每完成一
2、個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。DNA經(jīng)EB染色，EB可與核酸結(jié)合，在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生熒光。現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。引言Ti質(zhì)粒是土壤農(nóng)桿菌的天然質(zhì)粒，該質(zhì)粒上有一段特殊的DNA區(qū)段，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，該DNA區(qū)段能自發(fā)轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞，并插入植物染色體DNA中。所以Ti質(zhì)粒上的這一段能轉(zhuǎn)移的DNA被叫做T-DNA。將Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造，
3、將感興趣的基因放進(jìn)T-DNA區(qū)段中，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)χ参锏倪z傳轉(zhuǎn)化。T-DNA插入基因內(nèi)部導(dǎo)致基因突變：T-DNA插入到植物染色體上的位置是隨機(jī)的。如果T-DNA插入進(jìn)某個(gè)功能基因的內(nèi)部，特別是插入到外顯子區(qū)，將造成基因功能的喪失。所以利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，是獲得植物突變體的一種重要方法。農(nóng)桿菌能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。這使農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的應(yīng)用范圍受到了一定的限制。反向遺傳學(xué)研究的首要條件是獲得基因敲出突變體，建立可靠、有效、方便的T-DNA插入突變體的鑒定方法。其
4、中，“三引物法”是主要鑒定方法之一?！叭锓ā奔床捎萌齻€(gè)引物（LP、RP、BP）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。野生型植株目的基因的兩條染色體上均未發(fā)生T-DNA插入，所以其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅有1種，電泳結(jié)果為一條大帶（由LP+RP這一對(duì)引物擴(kuò)增出來(lái)）；純合突變體植株目的基因的兩條染色體上均發(fā)生T-DNA插入，也只能得到1種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告電泳結(jié)果為一條小帶（由BP+RP這一對(duì)引物擴(kuò)增出來(lái)）；雜合突變體植株只在目的基因的一條染色體上發(fā)生了T-DNA插入，所以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有2種，電泳結(jié)果為一條大帶由（LP+RP這一對(duì)引物擴(kuò)增出來(lái)）和一條小帶（由BP+
5、RP這一對(duì)引物擴(kuò)增出來(lái)）。電泳結(jié)果差異明顯，能有效區(qū)插入突變體的類(lèi)型。此法優(yōu)點(diǎn)是可同時(shí)鑒定出純合突變體并確證T-DNA的插入情況。本方法操作簡(jiǎn)單，成功率高，結(jié)果可靠，適用于從大量擬南芥T—DNA插入突變體中快速鑒定出突變體?！緦?shí)驗(yàn)材料】1.試劑：液氮，2*CTAB提取液，氯仿-異戊醇（24：1），無(wú)水乙醇，70%乙醇，TE，PCR反應(yīng)體系（DNA模板（基因組DNA），引物L(fēng)P、RP、BP，緩沖液，MgCl2，dNTPmixture，ddH2O，Taq酶），瓊脂糖凝膠電泳（瓊脂糖，1×TAE緩沖液，Loadingbuffer，DL2,000DNAMark
6、er，λ-HindⅢDNAdigestMarker，溴化乙錠。2.器具：1.5ml離心管，水浴鍋，微量移液器，離心機(jī)，PCR儀，微波爐，電泳儀，電泳槽，梳子，三角瓶，微量天平，手套，染色盤(pán)，凝膠成像儀。3.材料：擬南芥T-DNA插入突變體植株?！緦?shí)驗(yàn)步驟】提取擬南芥基因組DNA1.在1.5ml離心管中放入2或3片擬南芥幼嫩葉片，用液氮將其研磨成細(xì)粉，向管中加入600ul預(yù)熱至65℃的2×CTAB提取液，輕搖混勻。2.65℃水浴30min，其間輕搖混勻。3.向上清液加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1），室溫下輕輕混勻10min，12000rpm離心15m
7、in，再轉(zhuǎn)移上清入新管。4.向上清液中2倍無(wú)水乙醇或等體積的異丙醇，小心混勻，-20℃下30min，12000rpm離心15min，棄上清。5.用70%乙醇洗滌沉淀一次，12000rpm稍離心，棄上清。6.將沉淀晾干，加20-50ulTE(pH8.0)，65℃水浴30min溶解DNA。PCR4山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告取3個(gè)PCR小管（一個(gè)為三引物體系，另外兩個(gè)為雙引物體系），按照如下反應(yīng)體系向PCR小管內(nèi)加入樣品，設(shè)定如下反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系：三引物反應(yīng)體系25ul體系雙引物反應(yīng)體系25ul體系H2O15ulH2O16ul10xTaqbuffer(M
8、gCl2free)2.5ul10xTaqbuffer（MgCl2free)2.5ulMgCl2
