干細(xì)胞移植的示蹤技術(shù)

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1、中華醫(yī)學(xué)雜志2005年10月26日第85卷第40期NatlMedJChina,October26,2005,Vol85,No140·2873··綜述·干細(xì)胞移植心肌再生監(jiān)測的示蹤技術(shù)研究進(jìn)展錢海燕楊躍進(jìn)心肌梗死后,心肌細(xì)胞永久性丟失。且成熟心肌不可再染效率較低,而較少應(yīng)用于心肌再生的干細(xì)胞標(biāo)記。生,不可能通過分裂增殖來彌補(bǔ)病理性細(xì)胞數(shù)量減少。雖然目前心肌再生常用的報告基因主要有:綠色熒光蛋白近來有研究證實在心肌梗死后梗死區(qū)邊緣有少量心肌細(xì)胞(greenfluorescentprotein,GFP)及增強(qiáng)綠色熒光蛋白發(fā)生有絲分裂,但這種分裂十分微弱,根本不足以代償有臨(

2、enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因,β2半乳糖苷床意義的壞死心肌?，F(xiàn)有治療手段也無法促使心肌再生。酶(β2galactosidase,β2Gal、LacZ)基因和性別錯配的細(xì)胞因此,使用細(xì)胞移植至受損心臟替代壞死心肌,以修復(fù)移植。心肌結(jié)構(gòu)和功能,近年來已取得令人鼓舞的積極成果。但也11綠色熒光蛋白和增強(qiáng)綠色熒光蛋白:(1)結(jié)構(gòu):至今存在很多問題有待解決,核心問題是移植細(xì)胞在宿主體內(nèi)的只有水母中的GFP基因被克隆。水母中的GFP由238個氨去向和命運。用于移植的供體細(xì)胞包括心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)基酸組成,相對分子質(zhì)量為27000。

3、野生型GFP被紫外光[1]胞、干細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種類型,其中尤以干細(xì)胞是近年和藍(lán)光激發(fā)后,能發(fā)出綠色熒光。野生型GFP有一些特來的研究熱點。點,如熒光較弱、易受溫度影響、產(chǎn)生熒光過程滯后等。[2]為了追蹤觀察移植細(xì)胞的存活、滯留、分布和分化情況,EGFP等GFP的突變體可以克服這些不足。(2)特點:必須將移植細(xì)胞加以標(biāo)記,以便于識別和監(jiān)測。由于技術(shù)上GFP最大的特點是不需要底物或輔因子,可對活體檢測,因的原因,目前尚難以對干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的分布進(jìn)行準(zhǔn)確而可對被標(biāo)記對象進(jìn)行動態(tài)、連續(xù)的觀察。①體積小,只有量化,也不能對干細(xì)胞在移植后是否分化進(jìn)行在體監(jiān)測,只LacZ

4、的1/5。②即使是在甲醛或戊二醛固定的標(biāo)本中,GFP能處死動物后利用心臟組織切片進(jìn)行定性和半定量分析,而的熒光仍能保持穩(wěn)定。③檢測方便,常用熒光顯微鏡或共聚這與臨床應(yīng)用要求相去甚遠(yuǎn)。近來有一些研究使用新的標(biāo)[3]焦顯微鏡觀測。(3)GFP在干細(xì)胞移植中的應(yīng)用:Orlic等記方法對細(xì)胞移植后的分布等情況進(jìn)行在體監(jiān)測,取得很好-+將EGFP轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓Linc2kit細(xì)胞,注射至雌性小鼠效果。作者就近年來干細(xì)胞移植心肌再生的標(biāo)記方法作一梗死心肌邊緣,9d±2d后發(fā)現(xiàn)EGFP陽性細(xì)胞在移植部位介紹。[4]存活,有心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)。Min等將轉(zhuǎn)染GFP基一、外源性標(biāo)記

5、基因轉(zhuǎn)染因的豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell,MSC)注射應(yīng)用基因重組方法將外源性報告基因和特定的載體連至缺血心肌邊緣,6周后發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞表達(dá)GFP,并且標(biāo)記接、導(dǎo)入干細(xì)胞,該報告基因在干細(xì)胞中表達(dá)的蛋白具有特的移植細(xì)胞在心臟中表達(dá)α2肌球蛋白重鏈(α2MHC)和心肌殊的生物、化學(xué)或物理特性,可以用于檢測。攜帶報告基因肌鈣蛋白Ⅰ(cardiactroponinⅠ,cTn2Ⅰ)。Kuramochi等[5]的干細(xì)胞移植后在心臟中持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)標(biāo)記蛋白,處死動使用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠,將其骨髓單個核細(xì)胞靜脈注射至心物后對組織切片進(jìn)行鑒定,可以研究移植細(xì)

6、胞是否滯留、存肌梗死小鼠,長達(dá)3個月之久仍能在梗死邊緣發(fā)現(xiàn)GFP和活或分化成心肌細(xì)胞。這種方法的特點是準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定,cTn2Ⅰ雙重陽性的細(xì)胞,表明移植細(xì)胞存活并分化成心肌細(xì)一旦移植細(xì)胞在體內(nèi)未能存活,重組入干細(xì)胞中的報告基因胞。而Nygren等[6]取GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的造血干細(xì)胞,注射隨之崩解,不會假陽性標(biāo)記周圍宿主細(xì)胞。但檢測必須在組至損傷心肌和其邊緣,發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞在移植部位有效地存織標(biāo)本上進(jìn)行,因而要處死動物,所以這一標(biāo)記技術(shù)主要應(yīng)活,但為時短暫、未能分化為心肌,他們認(rèn)為干細(xì)胞移植后并用于動物實驗。未發(fā)生分化,而是細(xì)胞融合的結(jié)果[6]。影響報告基因表達(dá)的關(guān)鍵因

7、素是載體的選擇。研究表21β2半乳糖苷酶基因(LacZ基因):(1)LacZ基因結(jié)明攜帶報告基因的載體不同,對報告基因的持續(xù)表達(dá)時間有構(gòu)、特點:β2半乳糖苷酶基因編碼β2半乳糖苷酶,由4個亞基顯著影響,應(yīng)用腺病毒載體由于免疫原性強(qiáng)而被機(jī)體排斥,組成,可催化乳糖分解,還可催化乳糖類似物X2gal(52溴242所以在體表達(dá)持續(xù)時間只有2～3周,不利于長期觀察。目氯232吲哚2β2D2半乳糖苷)水解,產(chǎn)物呈藍(lán)色,便于檢測和觀前應(yīng)用較多的是腺相關(guān)病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,因其免察。(2)Lac2Z基因在干細(xì)胞移植中的應(yīng)用:LacZ基因是目疫原性弱,不影響報告