人血白蛋白的原核表達(dá)及應(yīng)用-論文.pdf

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1、生物技術(shù)通報(bào)·研究報(bào)告·BIoTECHNoLoGYBULLETIN2013年第11期人血白蛋白的原核表達(dá)及應(yīng)用李向茸。馮若飛謝晶瑩田偉楊妍梅。王丹馬忠仁(1.西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州730030;2.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心,蘭州7300303.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與T程學(xué)院,蘭州730030)摘要:旨在構(gòu)建人血白蛋白(HSA)基因的原核表達(dá)載體pGEX一4T一1rHSA,誘導(dǎo)表達(dá)后純化重組HSA蛋白,制備多克隆抗體并對(duì)其進(jìn)行鑒定。根據(jù)GenBank發(fā)表的HSA(NM一000477.5)的核苷酸序列設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性引物,以人胚肺二

2、倍體細(xì)胞的總RNA為模板,利用RT.PCR擴(kuò)增HSA基因,將其克隆至pGEX.4T一1載體,構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX.4T.1.rHSA,經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)變性、復(fù)性、親和層析純化后作為免疫原制備多克隆抗體,應(yīng)用間接ELISA和Western—blot方法對(duì)所得抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,重組蛋白主要以包涵體的形式存在,分子質(zhì)量為92kD;重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性;應(yīng)用其制備的抗血清效價(jià)達(dá)到1:10000;純化的多克隆抗體與血源人血清白蛋白和重組人血白蛋白均能產(chǎn)生特異性結(jié)合,具

3、有良好的生物學(xué)活性。關(guān)鍵詞:人血清白蛋白原核表達(dá)包涵體多克隆抗體ProkaryoticExpressionandApplicationofRecombinantHumanSerumAlbuminLiXiangrong'FengRuofei’XieJingying3TianWei。YangYanmeiWangDanMaZhongren(1.TheKeyBio-engineeringandTechnologylaboratoryofNationalityCommission,NorthwestUniversityforNationalities,Lanzhou7303

4、0;2.GansuEngineeringResearchCenterforAnimalCell,Lanzhou730030;3.LifeScienceandEngineeringCollegeofNorthwestUniversityforNationalities,Lanzhou730030)Abstract:ThisstudywasaimedtoexpressandpurifytheproteinofpGEX·-4T-1-rHSAinprokaryocytesandprepareanti·-HSApolyclonalantibody.TheHSAgenewas

5、amplifiedfromhumanembryolungdiploidtotalRNAbyRT—PCR,withprimersbasedonthepublishedHSA(NM_00047.5)sequenceinGenBank.thenitwasclonedintoprokaryoticexpressionvectorpGEX一4T一1toconstructarecombinantexpressionvectorpGEX一4T一1一rHSA.ThepGEX一4T一1一rHSAwastransformedintoEcoliBL21(DE3).Thepurified

6、expressedproteinwasinjectedintoarabbitandthepolyclonalantibodywasthenprepared,whichwereidentifiedbytheindirectELISAandWestern—blotanalysis.Resultsshowedthattherecombinantproteinmainlyexistsintheinclusionbody,about92kDandithasgoodreactogenicityandimmunogenicity.TheELISAtiteroftheantise

7、rumwasapproximately1:10000.Western—blotanalysisrevealedthatthepurifiedpolyclonalantibodyagainstpGEX一4T一1一rHSAhadaspecificaffinityfornaturalhumanserumalbuminandtheexpressedprotein.KeyWOrds:HumanserumalbuminProkaryoticexpressionInclusionbodyPolyclonalantibody人血清白蛋白(HumanSerumAlbumin,HSA

8、)廣泛應(yīng)用

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