基于質(zhì)譜分析的定性蛋白質(zhì)組學方法

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1、基于質(zhì)譜分析的定性蛋白質(zhì)組學方法齊孟文中國農(nóng)業(yè)大學現(xiàn)代質(zhì)譜是蛋白質(zhì)分析與研究的基本實驗技術,這里簡要介紹有關蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜原理、實驗平臺,及其質(zhì)譜解析算法,以期對相關領域的技術線路和實驗方法有一基本了解。1.現(xiàn)代生物質(zhì)譜的一般結(jié)構生物質(zhì)譜得益于兩種軟電離技術的發(fā)展,即基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)和電噴霧電離(ESI)。圖.MALDI電離原理示意圖,一般得到單價的正離子。孫漢昌,2011,蛋白質(zhì)組質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理關鍵問題與技術研究。圖.ESI電離的示意圖,一般得到多價態(tài)的離子。圖片來自,孫漢昌,2011,蛋白質(zhì)組質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理關鍵問題與技術研究。2.定性蛋白組學的實驗平臺

2、圖.ABI4700質(zhì)譜儀組成、常用實驗策略和數(shù)據(jù)處理。圖片來自張記陽,2007,蛋白質(zhì)組學中串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜庫結(jié)果質(zhì)量控制方法研究。圖.LTQ-Orbitrap質(zhì)譜平臺及常用實驗流程。圖片來自張記陽,2007,蛋白質(zhì)組學中串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜庫結(jié)果質(zhì)量控制方法研究。3.蛋白質(zhì)組學的實驗策略在基于質(zhì)譜技術的蛋白質(zhì)組學研究中,有兩種基本的實驗策略:自底向上策略(Bottom-up)和自頂向下策略(Top-down)。自頂向下策略是以蛋白質(zhì)分子整體作為分析對象,通過蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋(peptidemassfingerprinting,PMF)對蛋白進行鑒定的方法。為了有效地克服質(zhì)量簡

3、并的現(xiàn)象,減少搜索目標的范圍,一般選擇高精度和高分辨率的質(zhì)譜,如傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(2ppm,50000)。該策略具有較高的序列覆蓋度和翻譯后修飾特征的保持,適合于翻譯后修飾及特殊的蛋白質(zhì)異構體的分析。不足的是,(1)實驗樣品蛋白質(zhì)需要高度純化;(2)在目前的實驗條件下,較難分析大分子量的蛋白質(zhì)。自底向上策略,稱之為鳥槍法,是利用串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù),即肽碎片指紋(peptidefragmentfingerprinting,PFF)來鑒定肽段序列,然后再推斷組裝樣品中包含的蛋白質(zhì),是常用的高通量分析策略。由于肽碎片攜有呈幾何增長的組合信息,可以消除質(zhì)量簡并之憂,對質(zhì)譜的

4、質(zhì)量分辨率要求不高,多用于對復雜樣品的混合物進行高通量分析。圖.自底向上策略和自頂向下策略示意圖。孫漢昌,2011,蛋白質(zhì)組質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理關鍵問題與技術研究。4.串聯(lián)質(zhì)譜生產(chǎn)特點及解析利用低能惰性氣體誘導碰撞,使肽骨架各種鍵斷裂,生成N端的-a,b-,-c類和C端的x-,y-,-z類6種系列離子,低能CID主要產(chǎn)生y-,b-,其次是-a離子。另外兩個骨架鍵斷裂往往會形成內(nèi)部碎片,如氨基一酰基離子(amino-acyliumion),亞氨(immnonim)離子等。碎片離子還有可能丟失一個中性分子基團(比如水或者氨分子)形成新的離子,高能量CDI則還可導致側(cè)鏈的斷裂而得到其它

5、類型的離子。AnIntroductiontoBioinformaticsAlgorithmswww.bioalgorithms.infob2-H2Ob3-NH3a2b2a3b3HONH+3

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7、R1OR2OR3OR4

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17、H--N---C---C---N---C---C---N---C---C---N---C--COOH

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24、圖.CID作用下肽鍵的斷裂方式HHHHHHHy3y2y1y3-H2Oy2-NH3圖.部分離子示意舉例不同類系列間存在一定的聯(lián)系,如質(zhì)量和的關系a+x=b+y=c+z,和ax,b和y以及c和z稱為互補的離子,互補ii-nii-nii

25、-ni-nii-nii-n離子的質(zhì)量和等于母離子的質(zhì)量。相鄰的離子,比如b和b+1,y和y+1等則iiii稱為連續(xù)離子,連續(xù)離子之間的質(zhì)量差正好是一個氨基酸的質(zhì)量,某類離子與其失水失氨離子稱為同源離子,同源離子之間相差某些分子基團,如CO,H2O,NH3等,因此其質(zhì)量的差值也可計算出來。AnIntroductiontoBioinformaticsAlgorithmswww.bioalgorithms.infob2-H2Ob3-NH3a2b2a3b3HONH+3

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27、R1OR2OR3OR4

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37、H--N---C---C---N---C---C---N---C--

38、-C---N---C--COOH

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45、HHHHHHHy3y2y1y3-H2Oy2-NH3圖.示意失去中性分子集團而產(chǎn)生的離子類型。圖.連續(xù)離子構成階梯式質(zhì)量序列5.實驗質(zhì)譜預處理基本流程質(zhì)譜儀產(chǎn)生的圖譜{mz/,I},包含質(zhì)荷比和信號強度的信息,由于酶切和CID碎裂都遵從一定的物理化學規(guī)律,蛋白質(zhì)和肽段產(chǎn)生的質(zhì)譜都具有特定的模式,這是利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行蛋白質(zhì)和肽段鑒定的理論基礎。從數(shù)據(jù)采集的角度來說,原始質(zhì)譜是質(zhì)譜儀按照固定的時間間隔采集得到的模式譜,其構成包括序列離子,內(nèi)部碎裂離子,以及電子和化學噪聲。電子噪聲是隨機分

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