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《小鼠肝炎病毒A59毒株結構蛋白基因的克隆-論文.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、AnimalHusbandry＆VeterinaryMedicine2014Vo1．46No．8小鼠肝炎病毒A59毒株結構蛋白基因的克隆陳曉娟，衛(wèi)振，劉迪文(浙江大學實驗動物中心，浙江杭州310058)摘要：為獲得小鼠肝炎病毒(mousehepatitisvirus，MHV)結構蛋白基因s1、s2、M及N，分別構建了4個重組質粒。依據(jù)GenBank公布的MHVA59毒株RNA全序列設計4對特異性引物，以A59RNA反轉錄得到的eDNA為模板，通過PCR擴增出Sl、s2、M及N這3個結構蛋白基因的4個片段，分別將其通過A—T連接入pMD一20
2、T載體后，雙酶切鑒定正確后，送出測序確認。將測序結果與GenBank序列比對，確認擴增得到的s1、s2、M及N的核酸序列與其相似度分別為100％，99％，100％和99％。試驗成功擴增出s1、s2、M及N的核酸序列，其構建的重組質?？梢宰鳛闄z測MHV的陽性對照，為建立RT—PCR快速檢測試驗小鼠MHV的方法提供生物材料。關鍵詞：小鼠肝炎病毒；RT～PCR；克隆中圖分類號：$852．6文獻標志碼：A文章編號：0529-5130(2014)08-0080—03小鼠肝炎是實驗小鼠常見的傳染病之一，其病原只能在P2生物安全實驗室進行操作，這就限制了
3、一體小鼠肝炎病毒(mousehepatitisvirus，MHV)多呈般實驗動物飼養(yǎng)管理機構對MHV日常檢測方法的建隱性或亞I臨床感染，但嚴重干擾小鼠試驗結果的準確立J。本試驗以MHVA59毒株的RNA為模板，設性，是清潔級及以上動物必須排除的微生物，也是國計了4對特異性引物擴增s1、s2、M和N蛋白的基標規(guī)定的實驗大小鼠必檢項目。小鼠肝炎病毒在分類因序列，并分別構建重組質粒，避免直接使用病毒作上屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬的單股正鏈RNA病毒，為陽性對照樣品的危害性，為早期快速診斷MHV建基因組大小約31kb，包括3個主要的結構蛋白，即立安全
4、、敏感、可靠的檢測方法打下了基礎。s蛋白、M蛋白和N蛋白?。s蛋白(刺突糖蛋白)1材料與方法約1300個氨基酸，構成病毒胞膜上的突起部分，以第717氨基酸分為2個部分，即Sl和S2。S1較易變1．1病毒RNA化，位于蛋白的氨基端，形成一個球狀結構，含有受A59小鼠肝炎病毒RNA由上海市實驗動物質量體結合位點；s2相對保守，位于蛋白的羧基端，形監(jiān)督檢驗站饋贈。成一個穿膜的棒狀結構，含有3個螺旋結構j。M1．2主要試劑蛋白(膜糖蛋白)約230個氨基酸，分信號肽、膜MiniBESTUniversalRNAExtractionKit、RT-PCR外
5、區(qū)、跨膜區(qū)、胞外區(qū)等5個功能區(qū)。N蛋白(核衣Kit、PrimeSTARHSDNAPolymerase、DNAA—Tailing殼蛋白)約450個氨基酸，與基因組RNA特異性結Kit、T—VectorpMD一20、DNALigationKit、MiniBEST合，位于病毒顆粒的核心。PlasmidPurificationKit、NdeI、SacI(均為TaKaRa目前，實驗室診斷MHV主要是ELISA等檢測特產(chǎn)品)，DH5oL感受態(tài)(北京全式金)。異性抗體，但動物感染病毒后需經(jīng)過一段時間才能產(chǎn)1．3引物設計生抗體，導致檢測的滯后性，不能及時反
6、映機體攜帶根據(jù)GenBank中MHVA59全基因序列病毒情況，造成結果誤判。此外，樣本量較少時檢測(AY700211．1)[93，用PrimerPremier5．0軟件設計4抗體會增加經(jīng)濟成本，不利于日常檢測。與此相比，對引物，見表1。引物由上海英濰捷基(上海)貿(mào)易RT—PCR技術以其快速、準確、樣本量小等優(yōu)點，成有限公司合成。為目前微生物檢測的研究熱點。MHV核酸檢測多以1．4eDNA模板制備其標準毒株作為陽性對照特異性檢測結構蛋白的部分RNA測定濃度后，進行eDNA制備。反轉錄體基因片段，由于病毒培養(yǎng)和提取的特殊性，以致于其系：MHV總
7、RNA1Ixg，5×PrimeScriptbuffer4L，PrimeScriptRTenzymemixI1IxL，OligodTPrimer(50收稿13期：2014—06—16~mol／L)1L，Random6mers(100i~mol／L)1IxL，作者簡介：陳曉娟(1983一)，女，助理實驗師，碩士加RnasefreedHO至20L。混勻后置于42℃水浴1通信作者：劉迪文，研究員，主要從事實驗動物研究、管理及h，85℃5min，冰浴冷卻備用。教學工作，E—mail：liudiwen2004@163．son·82·AnimalHusb
8、andry&VeterinaryMedicine2014Vo1．46No．840470480《Y皇0ZAT00：§§00AQ窘警A§A0￡鬣S蕊。s蠢箴￡芏毽毽蕊ATS圖3N基因
