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《DB22T 3111-2020 貓杯狀病毒檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、ICS11.220B41DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T3111—2020貓杯狀病毒檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法DetectionmethodofrealtimequantitativeRT-PCRforFelinecalicivirus2020-03-16發(fā)布2020-03-30實(shí)施吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T3111—2020前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：胡桂學(xué)、王開(kāi)、郭衍冰、姜雪、黃
2、海龍、呼延含蓉、趙艷麗、程榮華、伊淑帥、牛江婷。IDB22/T3111—2020貓杯狀病毒檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了貓杯狀病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法的試劑和材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟、結(jié)果判定和廢棄物處理的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于貓杯狀病毒核酸的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)
3、物檢疫3縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。Ct循環(huán)閾值（Cyclethreshold）Cdna互補(bǔ)脫氧核糖核酸（ComplementaryDeoxyribonucleicacid）DMEM改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco'smodificationofEagle'smedium）ORF開(kāi)放閱讀框（OpenReadingFrame）RNA核糖核酸（Ribonucleicacid）RT-PCR反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）4原理根據(jù)貓杯狀病毒衣殼蛋白ORF2的保守區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)引物和探
4、針。探針在5’端標(biāo)記FAM熒光素作為報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記Eclipse作為淬滅熒光基團(tuán)。反應(yīng)進(jìn)入退火階段時(shí)，引物和探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合，此時(shí)探針上熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)；反應(yīng)進(jìn)入延伸階段時(shí)，Taq酶發(fā)揮5’→3’的外切核酸酶功能，將探針降解。探針上的熒光基團(tuán)游離出來(lái)，所發(fā)出的熒光不再為淬滅基團(tuán)所吸收而被檢測(cè)儀所接收。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)往復(fù)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)形式增長(zhǎng)，熒光信號(hào)也相應(yīng)增長(zhǎng)。每個(gè)模板的Ct值與該模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。5試劑和材料5.1試劑1DB22/T3111—20
5、20除有特殊說(shuō)明外，所有實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的要求。5.1.1DMEM培養(yǎng)液。5.1.2液氮。5.1.3RNA提取試劑盒。5.1.4反轉(zhuǎn)錄試劑盒。5.1.5陽(yáng)性對(duì)照，為貓杯狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物或非感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA。5.1.6陰性對(duì)照，為不含貓杯狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液。5.1.7無(wú)RNA酶的水（Rnasefreewater）。5.1.8Taq酶。5.2材料5.2.1無(wú)菌拭子。5.2.2離心管，1.5mL、15mL和50mL。5.2.3吸頭，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL和0.5μL～10μL。5
6、.2.4無(wú)RNA酶吸頭，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL和0.5μL～10μL。5.2.5無(wú)RNA酶離心管，0.2mL和1.5mL。5.2.6研缽。5.2.7熒光定量PCR反應(yīng)管,根據(jù)熒光PCR儀要求選擇單管、八連排管或96孔熒光反應(yīng)板。5.3引物和探針引物及探針使用時(shí)配制成表1中濃度，置-20℃保存，6個(gè)月內(nèi)使用。表1引物序列和濃度序列濃度引物和探針名稱(chēng)5’―3’μmol/L上游引物FCTGACTTCAAATTTCATCTC0.20下游引物RTGGGAATTAAGTCAGAGG0.20探針(FAM)ATCTATGCTCACTCAT
7、GGATCTGTC(Eclipse)0.406儀器設(shè)備6.1冰箱，-20±2℃，-80±2℃。6.2高速冷凍離心機(jī)，12000r/min以上。6.3可調(diào)移液器，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL和0.5μL～10μL。6.4天平，感量0.01g。6.5恒溫水浴鍋，控溫范圍為室溫至100℃。6.6熒光定量PCR擴(kuò)增儀。7樣品7.1樣品的采集2DB22/T3111—20207.1.1將無(wú)菌拭子（5.2.1）在口腔和鼻腔內(nèi)，刮取分泌物，將拭子插入離心管（5.2.2）中，加蓋并標(biāo)記，冷藏送檢。7.1.2組織樣品主要采集氣管和肺臟，裝入一次性塑
8、料袋或其他
