愈傷組織培養(yǎng).pdf

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1、第三章愈傷組織培養(yǎng)?主要內(nèi)容:?材料的制備?愈傷誘導與分化?形態(tài)發(fā)生?愈傷的培養(yǎng)第一節(jié)植物材料（外植體）的制備1.一般植物組織都能誘發(fā)愈傷組織。:誘導愈傷組織的成敗關鍵主要不是實驗材料，而是培養(yǎng)條件，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。雙子葉植物為最多，單子葉植物(1990’s)，此外，裸子植物、蕨類和蘚類植物也有誘發(fā)成功的例子。2.材料必須完全無菌微生物一旦與培養(yǎng)基接觸，就迅速繁殖，抑制愈傷組織的生長。用抗菌素來抑制微生物的生長，在短時間有效，而且抗菌素只能對一定譜系中的細菌才產(chǎn)生作用，該譜系以外的微生物仍然可以大量繁殖?？咕剡€可能抑制

2、植物組織的生長。得到無菌材料，植物組織必須先進行消毒。有好幾種化學試劑都能起到表面消毒的作用，試劑的選擇及處理時間的長短要根據(jù)材料對試劑的敏感性來決定。一般都采用在消毒后能很容易去除的藥劑。因為消毒劑對植物細胞也有殺傷作用，若不去除就會妨礙愈傷組織的發(fā)生。例如用無菌水反復沖洗后可以把大部分藥劑都洗掉，或者能自動分解變成低毒性物質(zhì)。本氯酸鈉能分解成為具有殺菌效能的氯氣，然后就散失到空氣中。低濃度的氯化汞是一種令人滿意的消毒劑，只是難以去除，故在消毒后必須用大量清水沖洗材料。在材料放入消毒劑之前，先在乙醇中漂洗一下，可以使材料表面弄濕，從而使消

3、毒劑易于滲入并殺死微生物。3.外植體的大小和形態(tài)消毒后的植物材料，即可進行培養(yǎng)。從外表均一的外植體長出的愈傷組織，在開始階段是相當一致的，而從莖、根等器官切段上長出的則是一個混雜的愈傷組織。有些外植體外表上看來是由同一類細胞組成，例如煙草的髓、胡蘿卜的次生韌皮部、菊芋的塊莖等，這些細胞中DNA的含量有很大差別。這種差別可能是由于細胞核中染色體數(shù)目的差別，即倍性不同所造成的。接種的外植體的大小和形狀并不需要嚴格限制不能太小，小于肉眼能見的限度時，細胞分裂可能難以發(fā)生。故一般要求切塊的大小要適當。外植體的細胞數(shù)目多，獲得愈傷組織的機會也多。如果

4、目的僅在于得到愈傷組織，那末將莖的切段、葉、根、花、果實或種子，或其中的某種組織切成一片片或一塊塊放到培養(yǎng)基上就可以了。如果要定量地研究愈傷組織的發(fā)生，那末外植體的大小必須一致，形狀和組成也要基本相同。進行這類研究常選用組織塊較大的材料，例如胡蘿卜的貯藏根、馬鈴薯的塊莖、菊芋、荷蘭防風草等。這樣才能得到足夠數(shù)量的、無菌的、一致的、適合于培養(yǎng)的外植體。具體的操作過程：無菌的塊莖或塊根，用鉆孔器鉆出一批同一類薄壁組織圓柱形的組織，平行排列好。多把刀片等距離地固定在一組金屬片之間，一次切下去得到許多個長短一致的圓柱形的外植體。圓柱形大量地、準確地

5、得到外形相同的外植體。圓柱體的表面積大，利于組織塊和外界氣體和營養(yǎng)物的交換。外植體的損傷表面分泌物，具有促進愈傷組織形成的能力，因此表面積越大，產(chǎn)生分泌物數(shù)量也越多，愈傷組織的得率也越高。外植體的體積應盡可能小，從而得到較大數(shù)量的外植體。外植體最小的限度由其親本組織細胞的平均大小來決定。細胞數(shù)目。例如菊芋的細胞比胡蘿卜根次生韌皮部的細胞大三倍，一個3.8毫克的胡蘿卜外植體大約包含25，000個細胞，這樣一個外植體是能夠成活的。而同樣重量的菊芋外植體，由于細胞大而數(shù)目少，在分離過程中造成損傷往往難以成活。必須重量達到8毫克才包含約20，000

6、個細胞，使之易于成活。第二節(jié)愈傷組織的培養(yǎng)一、培養(yǎng)基培養(yǎng)基一般包括大量元素、微量元素和一種碳水化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。這樣簡單的培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基)只有很少幾種植物組織能夠培養(yǎng)和維持下去，大多數(shù)組織需要添加各種各樣的附加物（完全培養(yǎng)基），如維生素、氨基酸、糖醇，生長素、細胞分裂素、赤霉素、螯合劑如EDTA、各種營養(yǎng)性的提取物如椰子汁等。注意：選用完全已知的合成化合物，不大主張用復雜的天然產(chǎn)物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。必須強調(diào)：適合于誘發(fā)愈傷組織的培養(yǎng)基不一定適合于維持這些愈傷組織；適合于液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基也不一定適合于固體培

7、養(yǎng)。培養(yǎng)基中的N，大多數(shù)都用硝態(tài)氮，只有MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基中才用硝態(tài)和銨態(tài)的混合物。K的水平在近代的培養(yǎng)基中有逐漸提高的趨勢。有趣的是，各種離子濃度大為不同的培養(yǎng)基往往能使相同的組織快速生長。例如Hildebrandt培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基顯著不同，但二者都能培養(yǎng)煙草的愈傷組織。?注意：?激素的種類和用量的添加?一般誘導愈傷常添加2.4-D二、愈傷的培養(yǎng)方式：培養(yǎng)分為固體和液體培養(yǎng)兩大類。液體培養(yǎng)又分靜止和振蕩培養(yǎng)的二類。l繼代培養(yǎng)（傳代）：愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間后，由于養(yǎng)分的枯竭，水分的散失，組織代謝產(chǎn)物的積累，影響愈傷組織生長，

8、因此必須將組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上。一般在25-28℃下進行固體培養(yǎng)時，每隔4-5周進行一次繼代培養(yǎng)。組織塊較小時，繼代培養(yǎng)時可將整塊組織轉(zhuǎn)移。組織塊較大時，可先將組織分成幾小塊再