環(huán)丙沙星單克隆抗體的制備及其特性分析.pdf

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1、第33卷第2期福建水產(chǎn)Vo1．33NO．22011年6月JOURNALOFFUJIANFIsHERIESJun．2011文章編號：1006—5601(2011)02-0001-05環(huán)丙沙星單克隆抗體的制備及其特性分析樊海平，楊燕燕，辛志明，吳斌，曾占壯，余培建(1．福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建福州350002；2．福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院福建福州350002)摘要：以人工合成的牛血清白蛋白環(huán)丙沙星抗原(CPFX—BSA)免疫Balb／c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備抗CPFX—BSA的McAb，獲得1株穩(wěn)定分泌針對CPFX藥物的單克隆抗體細胞株5G4，腹水

2、效價達1．28×10一；SDS—PAGE電泳分析CPFXMcAb5G4蛋白重鏈和輕鏈的分子量約為50KD和25KD；抗體亞型為IgG3。根據(jù)ie—ELISA標準工作曲線，Ic50值為192．44ng／mL，最低檢測限為16．29ng／mL，與恩諾沙星交叉反應(yīng)率為62．45％。制備的環(huán)丙沙星單克隆抗體為試劑盒的研制、組裝奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：環(huán)丙沙星；單克隆抗體；間接競爭ELISA環(huán)丙沙星(cipmfloxacin，CPFX)屬于第三藥殘免疫學(xué)快速檢測技術(shù)的核心是制備出待檢藥代氟喹諾酮(fluoroquinolones，VQs)類藥物。水物的特異性單克

3、隆抗體(monoclonalantibody，產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，由于CPFX在肌肉和肝臟中殘留時McAb)J。研究利用福建省淡水水產(chǎn)研究所合成間久，消除速度緩慢，易引起水產(chǎn)品中的藥物殘的環(huán)丙沙星牛血清白蛋白載體完全抗原(CPFX—留H]。為了保障水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，必須加強水BSA)為免疫原，制備出環(huán)丙沙星單克隆抗體，產(chǎn)品中CPFX殘留的檢測和監(jiān)測。目前，CPFX的并進行特性鑒定與分析，為進一步研制快速、簡殘留檢測方法主要為儀器法，包括液相色譜、質(zhì)便的環(huán)丙沙星免疫學(xué)檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。譜以及液相質(zhì)譜連用等，OlutosinR等利用高效1材料與方法液相色譜熒

4、光檢測方法測定了牛乳及血漿中的環(huán)丙沙星及恩諾沙星(Enm)，牛奶中定量限1．1試劑與培養(yǎng)基(LOQ)達到2ng／mL，血漿中定量限(LOQ)達鹽酸環(huán)丙沙星(CPFX)標準品，含量到lng／mL-3J，RalphKrebber等應(yīng)用液質(zhì)連用分99．8％(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；CPFX—BSA和析法測定了組織樣品中的恩諾沙星及環(huán)丙沙星，環(huán)丙沙星卵白蛋白載體完全抗原(CPFX—OVA)檢測限達到251a~／kg，不同組織的平均回收率為(福建省淡水水產(chǎn)研究所水生動物病害防控研究室72～105％-4。儀器法檢測藥物殘留結(jié)果準確、穩(wěn)制備)；抗體親和純化試劑盒(

5、Pierce公司)；羊定、可靠，但是儀器設(shè)備與試劑價格昂貴、樣品抗鼠過氧化物酶標記抗體(武漢博士德生物技術(shù)前處理復(fù)雜，分析耗時較長，不利于養(yǎng)殖現(xiàn)場及有限公司)；弗氏不完全佐劑、HT培養(yǎng)基、HAT基層水產(chǎn)技術(shù)部門應(yīng)用。培養(yǎng)基、牛血清白蛋白(Sigma公司)；改良型利用免疫學(xué)方法檢測水產(chǎn)品中的藥物殘留，RPMI一1640培養(yǎng)基(Thermo公司)；其它試劑均進行水產(chǎn)品初篩，具有快速簡便、靈敏度高、特為國產(chǎn)。異性強等優(yōu)點，實用價值大，應(yīng)用前景廣闊。1．2試驗動物免疫基金項目：福建省屬公益類科研院所基本科研專項(閩科技[20o9]46號)；科技平臺建設(shè)(閩

6、科計[2009]37號)；福建省海洋與漁業(yè)重點項目(閩海漁[2010]2—27號)。作者簡介：樊海平(1967一)，男，研究員，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害研究。Tel：0591—83796968；E—mail：fanhaipingl6@163．COrn2福建水產(chǎn)2011焦Balb／c小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限個濃度的CPFX藥物標準品的鰻鱺肌肉樣本。按責(zé)任公司)實驗室暫養(yǎng)1w后進行免疫。2mg／mL建立的回歸方程計算藥物含量和添加回收率。加CPFX—BSA與弗氏完全佐劑等量乳化后進行首次標樣品的回收率計算公式：免疫；首免后第14d，CPFX—B

7、SA與等量弗氏不完全佐劑混合乳化二免；以后每2w進行一次加強回收率(％)=鬻免疫，不加佐劑，于五免后進行細胞融合。1．10抗體的特異性(交叉反應(yīng))l-3單克隆抗體雜交瘤細胞株的篩選與克隆化用系列濃度稀釋的甲磺酸培氟沙星、鹽酸二根據(jù)文獻-8進行CPFX—BSA單克隆抗體雜氟沙星、鹽酸沙拉沙星、甲磺酸達氟沙星、氧氟交瘤細胞株的篩選、單克隆化，建立、保存單克沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、硫酸鏈霉素、硫酸隆抗體雜交瘤細胞株，制備單克隆抗體細胞株小慶大霉素、硫酸新霉素、硫酸卡那霉素、強力霉鼠腹水。陽性細胞孔篩選按照結(jié)合了間接ELISA素、氟苯尼考、隱性孔雀石綠等

8、藥物進行ic—(iELISA)法和間接競爭ELISA(ic—ELISA)法ELISA實驗，測定CPFX單抗與其它藥物之間的