禽流感病毒單克隆抗體的研制.pdf

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1、第31卷第5期家畜生態(tài)學(xué)報(bào)Vo1．31NO．52010年9月ActaEcologiaeAnimalisDomasticiSep．2010禽流感病毒單克隆抗體的研制黃慶華，張果平，胡北俠，黃艷艷，王可(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南250100)[摘要]用低致病性禽流感病毒H9N2亞型(MildlyPathogenicAvianInfluenzaVirus，MPAIV)F株全病毒作為抗原，制備能夠用于建立ELISA檢測(cè)AIV的特異性單抗；以間接ELISA和HI試驗(yàn)篩選出陽(yáng)性克隆，并經(jīng)有限稀釋法三次亞克隆之后，共獲

2、得三株穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，在Dot—ELISA試驗(yàn)中三株單抗中的兩株與13個(gè)AIVHN國(guó)內(nèi)分離株、4個(gè)AIVHN國(guó)內(nèi)分離株都反應(yīng)，而與10個(gè)NDV國(guó)內(nèi)分離株，IBV、IB—DV、EDSV一76、SPF雞胚尿囊液不反應(yīng)。一株與13個(gè)AIVH。N國(guó)內(nèi)分離株反應(yīng)，與4個(gè)AIVH5N1分離株、NDV、IBV、IBDV、EDSV一76、SPF雞胚尿囊液不反應(yīng)。[關(guān)鍵詞]禽流感；單克隆抗體；間接ELISA；HI試驗(yàn)[中圖分類(lèi)號(hào)]$811．5[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1004—5228(2010)05—0099—

3、04禽流感(AvianInfluenza，AI)是由A型流感病弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、高糖型DMEM毒引起的禽類(lèi)感染和疾病的總稱(chēng)。雞、火雞、鴨、鵪粉、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG和IgM抗體、鶉等家禽和野禽均可感染。目前在全世界各種家禽單克隆抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒、丙烯酰胺均為Sigma和野生禽類(lèi)中，已分離到上千株禽流感病毒，并已證公司產(chǎn)品；甲叉雙丙烯酰胺、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核明家禽或舍飼禽類(lèi)在感染后，可表現(xiàn)為亞臨床癥狀，苷和L一谷氨酰胺為Fluka公司產(chǎn)品；氨基喋呤為輕度呼吸系統(tǒng)疾病，產(chǎn)蛋量降低或急性致死性疾Gib

4、ico公司產(chǎn)品；顯色底物OPD、DAB為華美公司病[1]。AI對(duì)世界養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成了威脅。世界動(dòng)物進(jìn)口分裝；滅菌小牛血清為鄭州佰安生物公司產(chǎn)品；衛(wèi)生組織(0IE)將高致病性禽流感(HPAI)列為A低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為上海東風(fēng)麗珠公司產(chǎn)品；其余類(lèi)傳染病。HPAI感染引起的死亡率很高，低病性常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。禽流?MPAI)感染造成的損失也相當(dāng)嚴(yán)重]。1．1．4儀器設(shè)備Millipore超純水儀、50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，Nunclon公司)，DG一1材料和方法5031型酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)儀(華東電子管廠)

5、、750A型1．1材料紫外分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)(CR21日立公1．1．1毒株本試驗(yàn)所用病毒有13個(gè)AIVH。N。司)、CO。培養(yǎng)箱(Forma公司)、電泳儀及轉(zhuǎn)印裝置分離株和4株AIVHN。分離株，1O個(gè)新城疫分離(Bio—Red公司)。株，IBV、IBDV、EDSV-76病毒均由揚(yáng)州大學(xué)保存。1．2方法1．1．2試驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系等BALB／C小鼠，ICR1．2．1雜交瘤細(xì)胞系的建立小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；骨髓瘤細(xì)1．2．1．1動(dòng)物免疫免疫程序參考有關(guān)文獻(xiàn)的方胞系SP2／O—Ag-14由本室保存；抗禽流

6、感高免血清法_5]。取AIVH。N。粗提蛋白與等量的弗氏完全由揚(yáng)州大學(xué)自制。佐劑充分乳化后，腹腔注射8周齡BALB／c小鼠1．1．3主要試劑藥品融合用PEG(MW4000)、200Fg，2周后取AIV粗提蛋白與等量的弗氏不完[收稿日期]2O1O一04—01，修回日期：2010一O4—19[作者簡(jiǎn)介]黃慶華(1979一)，男。山東濟(jì)南人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物疾病方面的研究工作。E-mail：huangqih@163．corn100家畜生態(tài)學(xué)報(bào)第31卷全佐劑充分乳化后，腹腔注射200g，4周后尾靜脈觀察，適時(shí)換液和

7、檢測(cè)。注射相同劑量的純化抗原，不加佐劑，3d后融合。1．2．1．3陽(yáng)性克隆的篩選和克隆參考文獻(xiàn)方法1．2．1．2細(xì)胞融合按文獻(xiàn)方法進(jìn)行]。尾靜進(jìn)行l(wèi)_5]。陽(yáng)性克隆的篩選采用間接ELISA和脈追加免疫3d后取BALB／c小鼠的脾細(xì)胞與處于HI試驗(yàn)。間接ELISA：首先以方陣法測(cè)得AIV對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SP2／O細(xì)胞在PEG(MW4000)作用下H?？乖PF雞胚尿囊液的最佳包被濃度，然后將融合，取ICR小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，融抗原用碳酸鹽包被緩沖液(pH9．6)稀釋至20g／合好的細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝96孔板

8、，置mL，尿囊液稀釋至10t*g／mL，分別包被酶標(biāo)板，每37℃、6CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，5d后用HT換去一孔50L，4℃過(guò)夜，PBST(PBS+0．5％Tween)洗半HAT培養(yǎng)基，7～10d后改用HT培養(yǎng)基，定期滌；用封閉液(PBST+10FCS)4。C封閉24h，PB表1三株單抗特異性鑒定結(jié)果Table1TheS