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1、．2980．查墮堂!!旦笙鲞箜!塑竺竺!!!型!al1．!，5，No．19細胞色素C信號通路在膽道梗阻大鼠中性粒細胞凋亡調(diào)控中的作用冰鄧通明，鄧雪松，倪勇，鄧浩源，汪長浩，黃文龍廣州醫(yī)科大學研究生學院(廣州510182)；廣東省深圳市第二人民醫(yī)院肝膽外科(518035)【摘要】目的探討細胞色素C(Cyt—c)信號通路在膽道梗阻大鼠中性粒細胞(PMN)凋亡調(diào)控中的作用。方法104只sD大鼠隨機分為正常組(NO組)、假手術組(s0組)、膽總管結扎組(BDL組)、Cyt—c干預組(BDL+Cyt—C組
2、)，NO組不作任何操作，BDL組、BDL4-Cyt—c組予膽總管結扎，s0組不予結扎和切斷膽總管，BDL十Cyt—c組則在結扎膽總管關腹后行尾靜脈注射Cyt—C(20mg／kg)。SO、BDL和BDL+Cyt—C組分別予細分術后l2、24、48、72h等4個時相。檢測外周血PMN數(shù)量，流式細胞儀測PMN凋亡率，分光光度法檢測PMN胞質(zhì)Caspase一8、Caspase一9及Caspase一3活化程度。結果BDL組各時相PMN凋亡率明顯低于NO組和SO組相應時相，差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)；
3、與NO組和s0組各時相比較，BDL組Caspase一9和Caspase一3活性明顯下降(P<0．05)；在BDL+Cyt—C組各時相中，Caspase一9、Caspase一3活性和PMN凋亡率均顯著高于BDL組；進一步相關性分析表明，Caspase一9、Caspase一3活性與PMN凋亡率均呈正相關(r=0．943，P<0．01；r=0．949，P<0．01)。Caspase一8活性在NO組、SO組、BDL組、BDL4-Cyt—C組中變化不明顯。結論膽道梗阻大鼠Cyt—c通路上游信號Caspas
4、e一9及Caspase一3活性的減弱，導致外周血PMN凋亡減少，在梗阻性黃疸誘發(fā)過度炎癥反應中具有重要意義；經(jīng)Cyt—C干預后，促進了PMN的凋亡，有利于炎癥反應的消退?！娟P鍵詞】梗阻性黃疸；細胞色素C；半胱天冬酶一3；中性粒細胞；炎癥反應中性粒細胞(polymorphonuclearneutrophil，PMN)流式細胞儀；Thermo多功能超微量核酸蛋白分析儀。在炎癥反應中扮演重要角色，其數(shù)量和功能的變化影1．2分組104只SD大鼠，隨機分為4組：正常組響機體炎癥反應的進程。我們前期實驗證實
5、外周血(NO組，n=8)、假手術組(SO組，=32)、膽總管結扎PMN凋亡的異常是導致梗阻性黃疸(obstructivejaun-組(BDL組，n=32)和Cyt—C干預組(BDL+Cyt—Cdice，OJ)過度炎癥反應的重要因素。但是，關于0J患組，n=32)。設定NO組為0時相，s0組、BDL組和者外周血PMN凋亡失控的機制，目前尚未研究清楚。BDL+Cyt—C組分為術后12、24、48、72h等4個時相，近年來，細胞色素C(cytochromeC，Cyt—C)信號通路在每個時相8只。調(diào)控細
6、胞凋亡的進程中的作用逐漸得到了認識。關于1．3模型制備BDL組及BDL+Cyt—c組術前禁食Cyt—c信號通路是否參與OJ患者外周血PMN凋亡的12h，自由飲水，采用10％水合氯醛0．4～0．5mL／100g調(diào)控，目前鮮有研究報道。為此，2012年7月至2014腹腔注射麻醉，腹正中線進腹，分離膽總管，靠近肝門年1月，本實驗通過建立膽總管結扎大鼠模型，給予外部用l號線雙重結扎，并于兩結扎線之間切斷，縫合關源性Cyt—C干預，探討Cyt—C信號通路對PMN凋亡腹；SO組除不結扎和切斷膽總管外，其余同
7、上；BDL+調(diào)控的作用。Cyt—c組則在結扎膽總管關腹后行尾靜脈注射Cyt—c(20mg／kg)；NO組不行任何操作。術后各組大鼠分籠1材料與方法喂養(yǎng)，自由飲水和進食專用飼料。1．1材料SPF級SD大鼠104只，雌雄不拘，質(zhì)量1．4外周血PMN的分離與純化取肝素抗凝的新鮮200～250g，購自廣東省醫(yī)學動物實驗中心，在深圳北京全血，采用梯度離心及紅細胞裂解法分離得到純化的大學香港科技大學醫(yī)學中心實驗室進行實驗。Cyt—C，PMN，應用臺盼藍染色法檢查PMN活力>98％，應Sigma公司；葡聚糖T
8、一500，Pharmacia公司；大鼠淋巴用Gimsa染色法檢查PMN純度>95％。細胞分離液，TBD公司；RPMI1640，Hyclone公司；胎牛1．5外周血PMN凋亡率的測定用無菌的去離子水血清(無噬菌體低內(nèi)毒素)，杭州四季青公司；Annexin—按1：4稀釋結合緩沖液；取1×10。·L的PMN懸液V—FITCKit購自Neobioscience公司；Caspase一8、5OL；用150L結合緩沖液重新懸浮細胞；加入5Caspase一9及Caspase一3分光光度法檢測試劑盒，凱基Anne
