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《綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠胎肝干細(xì)胞在體內(nèi)外定向分化的潛能.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、·358·中華消化外科雜志2014年5月第13卷第5期ChinJDigSurg，May2014，Vo1．13，No．5·論著·綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠胎肝干細(xì)胞在體內(nèi)外定向分化的潛能黃啟科黨立力阮柏張卓超劉杰王興鄭志剛陶開(kāi)山【摘要】目的探討綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠胎肝干細(xì)胞(FLSCs)在體內(nèi)及體外定向分化的潛能。方法取孕13d綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因C57BL／6J小鼠胚胎肝臟，經(jīng)機(jī)械消化和膠原酶消化獲得FLSCs并擴(kuò)大培養(yǎng)；成熟肝細(xì)胞來(lái)自于同品系小鼠成體肝臟，通過(guò)兩步灌注膠原酶消化法提取，流式細(xì)胞儀鑒定其干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)及自我增殖能力，RT—PC
2、R及Westernblot測(cè)定AFP表達(dá)；分別將FLSCs經(jīng)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)及TGF—B誘導(dǎo)分化后，Real—timePCR檢測(cè)Alb、角蛋白CK一7、8、19mRNA以及Westernblot檢測(cè)Alb、角蛋白CK一7、8、19蛋白在誘導(dǎo)前后的表達(dá)變化，鑒定其向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞雙向分化的能力；經(jīng)尾靜脈注射FLSCs到野生型C57BL／6J肝切除小鼠體內(nèi)，觀察其在肝內(nèi)重構(gòu)肝組織的能力。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，各時(shí)相點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，兩兩比較采用LSD—t檢驗(yàn)。結(jié)果成功克隆FLSCs細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離的FLSCs表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子
3、(EpCAM)、CD133、CD49f干細(xì)胞標(biāo)志物，其陽(yáng)性表達(dá)率分別為78．6％4-3．3％、31．7％±2．5％、47．6％4-1．8％。AFPmRNA在FCs和成熟肝細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為0．640-4-0．115和0．053-4-0．012，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1．383±0．265和0．243±0．227，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8．772，5．354，P<0．05)。超低黏附培養(yǎng)皿培養(yǎng)FLPCs和成熟肝細(xì)胞，其形成克隆球數(shù)目分別為(234．04-57．0)個(gè)和(5．0±2．O)個(gè)，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t：12．711，P<0
4、．05)。體外HGF誘導(dǎo)FLSCs分化，Alb、CK一8mRNA表達(dá)分別在8、10d到達(dá)峰值，分別為0．851±0．030和0．771-40．031；兩者蛋白水平于第1O天達(dá)峰值，分別為4．573±0．015和1．562±0．029。體外TGF—B誘導(dǎo)FISCs分化，CK一7、CK一19mRNA在第12天達(dá)峰值，分別為15．454±2．152和10．675-4-1．822；兩者蛋白水平于第14天達(dá)峰值，分別為3．4234-0．105和1．8924-0．081。在移植有FLSCs的肝切除小鼠體內(nèi)可檢測(cè)到表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的成熟肝細(xì)胞及膽管
5、細(xì)胞。結(jié)論分離的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因FLSCs能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光，具有顯著的肝干細(xì)胞特征和向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞雙向分化的潛能，且在體內(nèi)研究中具有良好的示蹤性。【關(guān)鍵詞】綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠；胎肝干細(xì)胞；分離；鑒定；示蹤ProtentialofdirecteddifierentiationoffetalliverstemcellsingreenfluorescentproteintransgenicmiceinvivoandinvitroHuangQike，DangLili，RuanBai，ZhangZhuochao，Liufie，Wang，ZhengZ
6、higang，TaoKaishan．DepartmentofHepatobiliarySurgery，XifingHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xian710032，ChinaCorrespondingauthor：TaoKaishan，Emaif：taokaishan0686@163．corn【Abstract】0bjeetiveToinvestigatethepotentialofdirecteddifferentiationoffetalliverstemcellsfFLSCs)inmic
7、ewithsponataneousgreenfluorescencenvitroandnvivo．MethodsFLSCsweretakenfromgreenfluorescentproteintransgenicmiceatembryonicday13．Aftermechanicaldissectionandenzymedigestionwithcollagenase，F(xiàn)LSCswerefurthercultured．Theexpressionofstemcellrelatedmarkersandtheself-renewalabilitywerei
8、dentifiedbyflowcytometry．Theexpressionofalphafe
