土壤石油降解菌的篩選與微生物生態(tài)修復(fù)研究.doc

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1、土壤石油降解菌的篩選與微生物生態(tài)修復(fù)研究第一章文獻(xiàn)綜述1土壤石油污染概述石油成分根據(jù)其在不同溶劑中的溶解難易程度可分為油質(zhì)、膠質(zhì)、浙青質(zhì)等⑴。油質(zhì)是石油中含量最高的組分，主要成分為飽和烴以及芳香輕，其溶劑范圍廣，可溶于大多數(shù)的中性有機(jī)溶劑，但不被桂吸附。膠質(zhì)是石油中分子量較大的烴類(lèi)，它只能溶解于石油醚、苯、氯仿、乙醚和四氯化碳等有機(jī)溶劑中，能被娃膠吸附，密度較小的石油膠質(zhì)含量約4?5%，而較重的石油其膠質(zhì)含量可達(dá)20%以上。浙青質(zhì)是石油中的含硫的高分子多環(huán)有機(jī)化合物，不溶于石油醚或酒精，可溶于苯、三氯甲院及二硫化碳，同樣可被娃膠吸附。2微

2、生物修復(fù)技術(shù)的研究現(xiàn)狀微生物修復(fù)技術(shù)利用修復(fù)系統(tǒng)中的微生物，以環(huán)境中的污染物為底物，進(jìn)行相應(yīng)的代謝活動(dòng)以將其分解利用，降低環(huán)境中污染物質(zhì)的濃度或使其完全去除，達(dá)到環(huán)境修復(fù)的目的。與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)修復(fù)方法相比，微生物修復(fù)技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：首先，成本低：物理法需要大量且昂貴的修復(fù)儀器，而化學(xué)法需要向環(huán)境中投加大量的化學(xué)修復(fù)劑，微生物修復(fù)技術(shù)是所用方法中最廉價(jià)的；其次，無(wú)污染：物理法采用的焚燒方式會(huì)產(chǎn)生大量的有毒有害氣體，造成污染的進(jìn)一步擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，而化學(xué)試劑的大量投加使得二次污染問(wèn)題越來(lái)越突出；再者，微生物修復(fù)技術(shù)不破壞待修復(fù)區(qū)域的土壤結(jié)構(gòu)

3、以及地表植被，可最大限度的恢復(fù)土壤和水體的生態(tài)環(huán)境。第二章石油污染土壤的微生物生態(tài)分析1材料與方法樣品來(lái)源：釆集于大慶油田地區(qū)的石油污染土壤。原油：釆自大慶油田的脫水原油，黑色粘稠液體。土壤樣品采自大慶油田的表層土壤，采樣地臨近油井，土壤類(lèi)型為常年石油污染的土壤，按與油井距離依次為5、10、15、20、30、50m處，分布A、B、C、D、E、F6個(gè)采樣點(diǎn)，同一取樣點(diǎn)在2in2范圍內(nèi)進(jìn)行取樣。取樣時(shí)，先用取樣去除1cm左右土壤表層，然后在距土層表面1~5cm深度重復(fù)釆樣3次，去除樣品中帶有的植物殘?bào)w、砂石等大顆粒雜質(zhì)后，分成兩份裝入滅菌封口

4、塑料樣品袋中并標(biāo)記，一份冷凍干燥后測(cè)定土壤的含油量，以評(píng)估石油污染程度，一份置于4'C冰箱保存待提取DNA。2結(jié)果與分析石油污染導(dǎo)致土壤中的總有機(jī)碳含量升高，而對(duì)于土壤的其他理化性質(zhì)諸如全氮、水解氮、全憐、全鉀以及速效鉀含量無(wú)顯著影響。因此本文將土壤中的含油量作為衡量石油污染程度的指標(biāo)，隨著采樣點(diǎn)與油井距離的減小，6組樣品的含油量呈遞增趨勢(shì)，石油污染程度逐漸增高，這是符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合對(duì)土壤污染情況的分析，以重點(diǎn)分析不同污染程度下的群落特征，以及隨著污染程度的變化，其微生物群落的相應(yīng)更替，從中得出大慶油田石油污染程度與群落特征的變

5、化規(guī)律，探究其土著微生物群落的自身特點(diǎn)，為以后的生物修復(fù)工作提供生態(tài)學(xué)研究基礎(chǔ)。T-RFLP技術(shù)通過(guò)使用具有突光標(biāo)記的特殊引物，對(duì)土壤中的總微生物16SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)突光信號(hào)燈檢測(cè)得到掃描圖譜，由于核苷酸序列就有多態(tài)性，不同的微生物種群會(huì)顯示出不同的信號(hào)程度，表現(xiàn)在圖譜上則是不同的峰，從而可以直觀的顯示出樣品土壤的優(yōu)勢(shì)微生物群落的數(shù)量以及相互關(guān)系。綜上所述，含油量在1104mg-kg-'(E組）以下的土壤中尚未形成已適應(yīng)石油污染的微生物種群，其微生物群落尚不具備自身修復(fù)的能力，此類(lèi)土壤的微生物修復(fù)更主要的是通過(guò)引進(jìn)外來(lái)微生物菌群

6、進(jìn)行土壤有害物質(zhì)的代謝和治理。而含油量在4975mg-kg-^(B組）及以上的土壤已形成比較穩(wěn)定的微生物群落，從中更有可能蹄選到高效的石油降解菌，特別的，113bp代表的優(yōu)勢(shì)菌群就是一個(gè)潛在石油降解菌株，同時(shí)，此類(lèi)污染土壤的微生物修復(fù)工作可通過(guò)投加適當(dāng)?shù)南跛猁}和磷酸鹽等外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，改善適于微生物的生長(zhǎng)環(huán)境，以促進(jìn)土著石油降解菌的對(duì)于有害污染物的降解效應(yīng)。以上的研究成果將為大慶油田區(qū)石油污染土壤是生態(tài)研究、菌株蹄選與生物修復(fù)的后續(xù)工作提供科學(xué)指導(dǎo)和理論依據(jù)，本論文后續(xù)將選取含油量在4975mg-kg-'(B組）及以上的土壤進(jìn)行高效菌株的蹄

7、選工作。第三章石油概菌的………………252結(jié)果與分析………………283本章討論…………………32第四章萘降解苗的分………………331材料與方法……………………?342結(jié)果與分析…………………41第五章石油降解苗群的優(yōu)……………511材料和方法……………552結(jié)果勾分析……………583本章討論…………………63第五章石油降解菌群的優(yōu)化與修復(fù)效果研究1材料和方法菌株來(lái)源：已蹄選到的4株石油降解菌，分別為W-2、W-3、W-5、W-7o原油：釆自大慶油田的脫水原油，黑色粘稠液體。土壤：采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓溫室試驗(yàn)田。將菌群中的各菌種分別接種到液

8、體LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后各吸取25mL的菌液混合配制成100mL的菌群培養(yǎng)液，離心收集菌體并加入無(wú)菌水制成菌懸液。稱(chēng)取0.2gNH4NO3和0.02gKH2PO4溶于50mL水中配制成營(yíng)養(yǎng)液