FISH實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序(FISH實(shí)驗(yàn)資料一).pdf

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1、FISH實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序(成都新基因格實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部完整版)一實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^熒光原位雜交實(shí)驗(yàn),輔助臨床醫(yī)療診斷:提高優(yōu)生優(yōu)育(產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用)、提前預(yù)防及治療病患(產(chǎn)后診斷及膀胱癌診斷等)、對(duì)腫瘤確診病人評(píng)估預(yù)后及中位生存期、無病痛生存期(Dsease-FreeSrvival,DFS),指導(dǎo)用藥及治療方案(針對(duì)乳腺癌、胃癌患者的HER-2基因診斷,針對(duì)CML患者的bcr/abl融合基因診斷等)。二實(shí)驗(yàn)原理利用DNA堿基對(duì)的互補(bǔ)性,將直接標(biāo)記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補(bǔ)的目標(biāo)樣本的DNA(玻片上的標(biāo)本)雜交,通過觀察熒光信

2、號(hào)在染色體上的位置反映相應(yīng)染色體的情況三儀器設(shè)備及耗材(一)儀器設(shè)備:①:全自動(dòng)分子雜交儀②:熒光顯微鏡及分析軟件③:恒溫水浴箱3個(gè)以上(小型號(hào))④:冰箱2臺(tái)(提供試劑和標(biāo)本存放,4攝氏度和-20攝氏度)⑤:離心機(jī)(用于羊水標(biāo)本以及血液標(biāo)本,絨毛標(biāo)本處理過程的離心)⑥:通風(fēng)櫥(配固定液,等操作)⑦:迷你離心機(jī)(探針,緩沖液的離心。可離1.5ml管、0.2ml管)⑧:考普林瓶15個(gè)(FISH實(shí)驗(yàn)中盛放各種試劑,溶液)⑨:移液槍(5ml,1000ul,200ul,10ul)放于雜交室和制備室。10:震蕩混勻器11:計(jì)時(shí)器,溫度計(jì)

3、,溫度濕度顯示器。12:載玻片盒(用于存放已經(jīng)FISH實(shí)驗(yàn)后的FISH片子)13:洗耳球,吸量管(10ml),燒杯,容量瓶,電子天平,常用天平稱。(二)耗材:載玻片(最好,帶磨砂的,寫用鉛筆患者編號(hào),因?yàn)椴粠ド暗馁N標(biāo)簽會(huì)被乙醇洗掉。)大蓋玻片(方形,用于鏡檢)小蓋玻片(方形或圓形,圓形佳,用于分子雜交時(shí)候封片)離心管(10ml,1.5ml,200ul)3ml一次性吸管個(gè)人防護(hù)用品,標(biāo)簽紙等。四實(shí)驗(yàn)樣本及試劑樣本:外周血,骨髓血,羊水,尿液,病理組織切片等。試劑:4%NaOH液、0.1%NP-40、20XSSC、2XSSC、

4、0.075MKcl、1MHcl、PBS緩沖液、0.08mg/ml胃蛋白酶工作液、200ug/ml蛋白酶K工作液、檢測(cè)試劑盒等。(二)各種溶液的配制2.1:制NaOH溶液a)用天平稱取4克分析純的NaOH固體,置于一只三角燒瓶中。b)用200ml量筒準(zhǔn)確取100ml蒸餾水,緩緩注入盛放NaOH固體的三角燒瓶中。c)搖蕩三角燒瓶使NaOH固體充分溶解。d)然后緩緩傾倒入250ml廣口瓶中,密封保存?zhèn)溆谩?.2:配制20XSSC溶液:取氯化鈉175.5g和檸檬酸三鈉88.2g,加入1000ml雙蒸水中,用磁力攪拌棒攪拌,使其完全溶

5、解,用濾紙過濾,調(diào)pH為5.3,封口膜封好,4℃保存?zhèn)溆?,有效?個(gè)月。2.3:配制2XSSC溶液:用20×SSC和雙蒸水,按1:9的比例稀釋,調(diào)pH為7.0,封口膜封好,4℃保存?zhèn)溆茫行?個(gè)月。2.4:2×SSC/0.1%NP-40配制50ml20×SSC(pH5.3)0.5mlNP-40449.5ml雙蒸水500ml調(diào)pH為7.0,封口膜封好,室溫保存?zhèn)溆?,有效?個(gè)月。2.5:系列酒精的配制取無水乙醇28ml和34ml,分別與12ml和6ml雙蒸水混合,配成70%和85%的酒精,與無水乙醇共同組成70%,85%,1

6、00%的系列酒精,封口膜封好,室溫保存?zhèn)溆?;另配制一上述系列酒精,封口膜封好?20℃室溫保存?zhèn)溆谩?.6:PBS緩沖液:PBS1L配方(pH7.4):磷酸二氫鉀(KH2PO4):0.27g,磷酸氫二鈉(Na2HPO4):1.42g,氯化鈉(NaCl):8g,氯化鉀(KCl)0.2g,加去離子水約800mL充分?jǐn)嚢枞芙?,然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4,最后定容到1L。高溫高壓滅菌后室溫保存。2.7:0.075MKcl低滲液:鉀5.59g加入1000ml去離子水中溶解(或Kcl2.794g溶入500ml去離子水中),備用,4攝氏

7、度低溫保存。2.8:固定液:按甲醇(AR):冰乙酸(AR)=3:1的比例配制細(xì)胞固定液,細(xì)胞固定液現(xiàn)配現(xiàn)用。2.9:1MHcl:取.9ml濃Hcl加去離子到100ml混勻,4℃保存?zhèn)溆?。保?個(gè)月。2.10:0.08mg/ml胃蛋白酶工作液:A:取40mg胃蛋白酶,放入1.5MLEP管中,加1ml去離子水溶解,分裝到10個(gè)200ul離心管中。B:次使用時(shí),在考普林瓶中加50ml去離子水,加入500ul1MHcl,加入一管分裝的胃蛋白酶溶液(100ul)。2.11:200ug/mlPK工作液:aPK儲(chǔ)存液(20mg/ml):稱

8、取0.1g蛋白酶K干粉溶于2XSSC(PH=7.0)溶液中,輕輕搖動(dòng),直至PK完全溶解,不要漩渦混勻。-20℃保存。b蛋白酶K工作液(200ug/ml):取0.4mlPK儲(chǔ)存液溶于40ml2XSSC(PH7.0)溶液中。五實(shí)驗(yàn)步驟(一):羊水樣本FISH實(shí)驗(yàn)SOP一:標(biāo)本預(yù)處理①:將新鮮收

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