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1、卵黃抗體生產(chǎn)及應(yīng)用技術(shù)進(jìn)展李建濤2003年6月內(nèi)容一、生產(chǎn)技術(shù)二、應(yīng)用技術(shù)三、問題及展望一、生產(chǎn)技術(shù)(一)IgY產(chǎn)生過程(二)IgY轉(zhuǎn)移時間、產(chǎn)量及影響產(chǎn)量的因素(三）IgY結(jié)構(gòu)特點(四)IgY相對與IgG的優(yōu)勢(五)IgY純化、活性測定及保存(一)IgY產(chǎn)生過程1.腔上囊是禽類特有的控制體液免疫的淋巴器官；2.腔上囊中B細(xì)胞受到抗原刺激后分化成漿細(xì)胞，后者分泌抗體進(jìn)入血液；3.通過血液循環(huán)和輸卵管上皮層分泌濾泡，產(chǎn)蛋雞將母源抗體選擇性分泌到卵黃內(nèi)；4.卵黃中Ig主要是IgG，叫IgY（IgM和IgA轉(zhuǎn)移到蛋清中
2、）；5.小雞通過IgY實現(xiàn)獲得性被動免疫(豬、牛、馬屬通過初乳；兔通過胎盤)；6.卵黃中含有多種不同抗體（約200種，滴度取決于暴露程度；M.Coleman,2000)；7.用某種病原菌免疫母雞，可產(chǎn)生特異性IgY，Sugita等（1996）用26種甲醛滅活病原菌免疫產(chǎn)蛋雞，IgY可預(yù)防多種疾病。(二)IgY轉(zhuǎn)移時間、產(chǎn)量及影響產(chǎn)量的因 素1.用HI、ELISA、ID檢查卵黃中IgY，抗體應(yīng)答形成時間晚于血清1～2周（TheresaHP,1985；鴨腺病毒），以后與血清測得的HI滴度一致，也有報道卵黃卵黃抗體具有
3、累積作用；2.經(jīng)加強免疫，卵黃中特異性IgY效價能維持?jǐn)?shù)月奶至1年；3.一個卵黃約含100～400mgIgY，一只產(chǎn)蛋雞每年可獲得40～50gIgY（D.Carlander,2002），相當(dāng)與30只家兔同期內(nèi)血清IgG產(chǎn)量；4.卵黃中抗原特異性抗體數(shù)量占IgY平均10%，范圍是5%（抗胰島素抗體）～28%（抗鼠IgG抗體），取決于免疫個體、免疫程序及抗原的免疫原性；續(xù)（2）5.影響IgY產(chǎn)量的因素包括：（1）抗原的質(zhì)與量（顆粒/可溶性抗原、類毒素/菌體抗原、活菌/死菌，免疫麻痹；高免疫原性和安全）（2）機(jī)體方面，
4、A包括產(chǎn)蛋雞品種（來航雞、洛島紅雞及其雜交后代的特異性IgY最高平均濃度有顯著差異（DCarlander,2002)、B產(chǎn)蛋率和產(chǎn)蛋間歇與IgY濃度、C蛋重及卵黃重、D營養(yǎng)影響免疫系統(tǒng)發(fā)育、免疫機(jī)能狀況和生產(chǎn)性能、E健康狀況（SPF雞群，起碼應(yīng)無免疫抑制性疾病和垂直傳播性疾病，對父母代IBD的免疫）（3）免疫途徑、免疫程序、佐劑續(xù)（3）6.生產(chǎn)卵黃抗體典型的免疫程序（Li-Chan等，2000）：(1)首免，胸肌注射0.5～1mg/羽弗氏完全佐劑等體積乳化抗原；(2)首免后第3、5、7和25周用弗氏不完全佐劑乳化
5、抗原進(jìn)行2～4次加強免疫，劑量逐步放大1～2倍。這種多次注射加強劑量的抗原使之產(chǎn)生較高自動獲得性免疫的過程，稱之為“超免疫作用”。（三）IgY結(jié)構(gòu)特點1.分子量160～180kDa，稍大于IgG（160kDa）；2.多一穩(wěn)定區(qū)而少一鉸鏈區(qū)（鉸鏈區(qū)有較多脯氨酸，具有韌性，與抗體分子構(gòu)型變化有關(guān)）；續(xù)（1）這種差異沒有影響IgY的抗原-抗體結(jié)合特性和結(jié)合能力，結(jié)合價也是2（Warr等,1995），然而對于pH、溫度及蛋白水解等引起構(gòu)象變化的環(huán)境條件，IgY比IgG穩(wěn)定；由于缺乏鉸鏈區(qū)，兩個抗原結(jié)合片段（Fab）緊密排
6、列，使IgY缺少韌性及功能種類，在確定條件下沉淀及聚合反應(yīng)能力降低（Warr等，1995），這使其具有抵抗幼齡動物胃酸屏障的能力。3.IgY能介導(dǎo)過敏反應(yīng)，與哺乳動物的IgE相似。（四）IgY相對IgG的優(yōu)勢1.高度保守的哺乳動物蛋白質(zhì)對禽有較強的免疫原性，且產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)所需抗原量?。―anielpour.D,1993），如IGF-1，且免疫應(yīng)答快；2.免疫反應(yīng)具有交叉性，血緣越近，交叉反應(yīng)程度越高；由于結(jié)構(gòu)上差異，IgY與IgG幾乎沒有交叉免疫反應(yīng)，減少了非特異結(jié)合和假陽性；減少非特異性結(jié)合使免疫學(xué)檢測靈敏
7、性提高（達(dá)50%）；3.IgY具有較強的抗熱、抗酸、抗離子強度和一定的抗酶分解能力（相對于IgG），提純后IgY在合適條件儲存10年滴度沒有損失（Olovson等，1993），幼畜可以口服，經(jīng)保護(hù)處理后成年動物也可以口服，提純后可以肌注（孫希琪，1995）；4.USDA和FDA認(rèn)為卵黃抗體是GRAS（generallyregardedassafe）且已允許商業(yè)生產(chǎn)用于人；續(xù)（1）5.符合動物福利原則。因此，IgY具有可規(guī)模生產(chǎn)、成本低、特異性抗體含量高、安全性好等優(yōu)點,比實驗室條件下通過實驗動物制備有限的高免血清
8、更有實用性。（五）IgY純化、活性測定及保存1.雞蛋儲存在+4℃條件下6個月IgY活性損失很小。用做食品和飼料添加劑，或獸醫(yī)臨床上，IgY多以全卵黃或其水溶液的形式直接利用，或制成干粉利用。2.用于診斷分析或純化生物活性分子，或在人醫(yī)臨床上則需要提高IgY純度或提純特異性IgY。IgY純化分三步：第一步是粗提，將含有IgY的水溶性蛋白與水不溶的脂類和脂蛋白分離，即除去脂質(zhì)
