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1、ICS65.120B22備案號(hào)：40469-2014DB32江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T2583-2013飼料中飼用芽孢桿菌的測定DeterminationofBacillusinfeed2013-12-20發(fā)布2014-01-20實(shí)施江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB32/T2583-2013前言本標(biāo)準(zhǔn)編寫按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的規(guī)定。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所、江蘇省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人為宦海琳、周維仁、閆俊書、白群安。DB32/T2583
2、-2013飼料中飼用芽孢桿菌的測定1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中飼用芽孢桿菌的測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料、預(yù)混料、飼料添加劑中飼用芽孢桿菌的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備GB/T4789.2-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定（原文中的參考文獻(xiàn)）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1芽孢桿菌bac
3、illus一類能形成芽孢（內(nèi)生孢子）的桿狀細(xì)菌的通稱。與飼料工業(yè)密切相關(guān)的芽孢桿菌主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)的枯草芽孢桿菌(Bacillussubulis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）、遲緩芽孢桿菌（Bacilluslentus）和短芽孢桿菌屬(Brevilbacillus)的側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)。3.2菌落數(shù)aerobicplatecount飼料檢樣經(jīng)
4、過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等）培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。4原理取一定量檢樣的稀釋液，將其在80℃下加熱10min，涂布在NA瓊脂內(nèi)，于36℃條件下培養(yǎng)48h，菌落計(jì)數(shù)，算出每g（mL）檢樣中的芽孢桿菌總數(shù)。5設(shè)備和材料5.1分析天平感量0.1g，0.1mg。5.2振蕩器5.3粉碎機(jī)1DB32/T2583-2013非旋風(fēng)磨，密閉要好。5.4恒溫水浴鍋5.5恒溫培養(yǎng)箱5.6pH計(jì)（精確到±0.1個(gè)單位）或精密pH試紙5.7滅菌錐形瓶500mL、250mL。5.8無菌吸管1mL（具0.01刻度）、
5、10mL（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸頭。5.9滅菌試管18mm×180mm、15mm×150mm。5.10滅菌玻璃珠5.11滅菌玻璃或塑料培養(yǎng)皿5.12玻璃涂布棒5.13光學(xué)顯微鏡1000倍。6稀釋液、培養(yǎng)基和試劑除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑，實(shí)驗(yàn)室用水采用蒸餾水或去離子水，或相當(dāng)純度的水。6.10.85%滅菌生理鹽水6.2營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基參見附錄A中的A.1。6.3革蘭氏染色液參見附錄中的A.2。6.4二乙酰（V-P）測定培養(yǎng)基和試劑參見附錄中的A.3。6.5L-阿拉伯糖發(fā)酵、D-木糖發(fā)酵、D-甘露醇發(fā)酵培
6、養(yǎng)基參見附錄中的A.4。6.6明膠液化培養(yǎng)基參見附錄中的A.5。6.7淀粉水解培養(yǎng)基參見附錄中的A.6。6.8丙酸鹽利用培養(yǎng)基參見附錄中的A.7。6.9檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基2DB32/T2583-2013參見附錄中的A.8。6.10硝酸鹽還原培養(yǎng)基和試劑參見附錄中的A.9。6.117%氯化鈉生長培養(yǎng)基參見附錄中的的A.10。6.12厭氧生長測定培養(yǎng)基參見附錄中的A.11。7檢樣的制備按照GB/T14699.1進(jìn)行采樣，采樣工具如鏟子、匙、采樣器、試管等，應(yīng)是無菌的。樣品送到微生物檢驗(yàn)室應(yīng)盡快檢驗(yàn)。按照GB/T20195進(jìn)行檢樣的制備，樣品制備
7、后應(yīng)盡快檢驗(yàn)。8操作步驟8.1試樣稀釋8.1.1以無菌操作稱取試樣25g（mL），放于含有225mL0.85%滅菌生理鹽水的滅菌三角瓶中（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠），置振蕩器上振蕩30min，經(jīng)充分振搖后，制成1：10的均勻稀釋液。8.1.2用無菌吸管或微量移液器吸取1mL的1:10稀釋液，沿管壁慢慢注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管，制成1:100的稀釋液。根據(jù)樣品含菌量，做進(jìn)一步的十倍系列遞增稀釋液。8.2接種和培養(yǎng)選擇2個(gè)-3個(gè)適宜的稀釋度，水浴80℃±1℃維持10min，每個(gè)稀釋度吸取0.1m
8、L稀釋液接種到兩個(gè)營養(yǎng)瓊脂平板上，使用涂布棒進(jìn)行表面涂布。涂布好的平皿蓋好，置室溫中放置15min使接種物完全被瓊脂吸收。翻轉(zhuǎn)上述平皿置36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。8.
