慢病毒(過表達)包裝步驟.doc

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1、慢病毒（過表達）包裝步驟秦超1.轉(zhuǎn)染復(fù)蘇293T細(xì)胞，傳2-3代進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染推薦使用合元公司的慢病毒轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染步驟：（以10cm培養(yǎng)皿為例）⑴最好在鋪細(xì)胞后20h左右進行轉(zhuǎn)染，控制轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度70%-90%，保證細(xì)胞處于良好的狀態(tài)，轉(zhuǎn)染前一小時把一半培養(yǎng)基（約5ml）換成新的（含血清，因為此轉(zhuǎn)染試劑不需換液）。⑵加psin10ug，pspax210ug，pmd2.g5ug于800ulopti-mem，混勻⑶加40ul慢病毒轉(zhuǎn)染試劑于800ulopti-mem，混勻，室溫靜置5min⑷將⑶所得的轉(zhuǎn)染試劑稀釋液滴加到⑵所得到的質(zhì)粒稀釋液中，邊加邊輕輕混勻

2、，室溫放置20min⑸取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，將⑷得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合體加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，前后輕輕推搖使混合均勻，放回培養(yǎng)箱。2.收毒(36-48h)收毒前如果質(zhì)粒帶有熒光標(biāo)簽可先看一下轉(zhuǎn)染效率，一般達到60%即可。⑴將培養(yǎng)皿中的病毒上清液吸出到15cm離心管中，然后2000rpm離心10min，以沉淀細(xì)胞碎片。⑵取上清用0.22um濾清過濾到濃縮管（用蛋白質(zhì)濃縮管即可）中。4000rpm離心至所需體積。⑶濃縮完畢后，吸出濃縮后的病毒液，按每次的接毒量分裝，-80℃凍存。由于反復(fù)凍融會降低慢病毒滴度，因此避免反復(fù)凍融。3.接毒接毒前12-20h鋪細(xì)胞，使接毒時細(xì)

3、胞密度約為40%-50%，務(wù)必使用生長狀態(tài)良好的細(xì)胞。將分裝好的慢病毒滴加到細(xì)胞中，加polybrene使其終濃度為8ug/ml細(xì)胞密度60%-70%時可以再接毒一次。4.檢測及培養(yǎng)細(xì)胞系(48h)如果帶有熒光標(biāo)簽可直接顯微鏡看一下感染效率，如需用藥殺用puromycin殺三天（對照組完全殺死），剩下的即為基因整合進去的細(xì)胞。如需培養(yǎng)成細(xì)胞系，可繼續(xù)培養(yǎng)。如果剩下的細(xì)胞較少可用高濃度血清，待細(xì)胞聚團時用胰酶消化一下，使細(xì)胞鋪勻。