生物單分子熒光檢測技術(shù)的比較-顯微鏡課件.ppt

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1、全內(nèi)反射熒光顯微鏡醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)05級張園鄭雪飛宋一萌解依荻發(fā)展歷史優(yōu)勢應(yīng)用分型及結(jié)構(gòu)基本原理發(fā)展與展望發(fā)展歷史熒光顯微鏡的概念全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的發(fā)展歷程細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。發(fā)展歷史熒光顯微鏡的概念在細(xì)胞生物學(xué)方面，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡始終不能解決生物樣本顯微中的幾個(gè)重要問題：1.顯微圖像的信噪比不高；2.光源對生物樣本照射的損傷；3.光學(xué)衍射所致的分辨極限（R≥0.61λ/nsinθ）：傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡由

2、于受到光瞳遠(yuǎn)場衍射效應(yīng)的影響,存在分辨極限,瑞利將之歸納為R≥0.61λ/nsin(u/2),其中R為分辨力,λ為成像光波波長,nsin(u/2)為物透鏡的數(shù)值孔徑,即NA值，u為孔徑角,因此光學(xué)顯微鏡空間分辨極限～250nm。發(fā)展歷史全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的發(fā)展歷程近年來人們開發(fā)出了一系列光學(xué)顯微鏡。其中，全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(Totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy,TIRFM)是近年來新興的一種光學(xué)成像技術(shù)。全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的發(fā)展歷程Hirschfield完成了第一個(gè)全內(nèi)反射熒光實(shí)驗(yàn)1965年Axelrod等生物物理

3、學(xué)家對TRIFM技術(shù)及基本原理進(jìn)行描述，并探索了其生物應(yīng)用。20世紀(jì)80年代早期20世紀(jì)90年代新型物鏡透鏡、聚光鏡和超靈敏探測器的出現(xiàn)，使TRIFM技術(shù)得到充分發(fā)展。1995年Yanagida小組用TIRFM技術(shù)首次在液體溶液中得到了熒光標(biāo)記的單個(gè)蛋白質(zhì)分子的成像。該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到許多單分子的研究中這是首次嘗試用全內(nèi)反射熒光法測液體中的單個(gè)分子的熒光。將全反射理論與生物細(xì)胞的熒光成像技術(shù)相結(jié)合是一種全新的突破。肌球蛋白酶活性測量，肌收縮力的產(chǎn)生，熒光標(biāo)記驅(qū)動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)研究。1996年Moerner小組又用這項(xiàng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了限制在丙烯酰胺膠體的納米孔中的單分子的三維成像。

4、至今基本原理全內(nèi)反射熒光顯微鏡的基本設(shè)計(jì)思路全內(nèi)反射熒光顯微鏡的基本原理全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)是利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的消逝波激發(fā)樣品,從而使樣品表面數(shù)百納米厚的薄層內(nèi)的熒光團(tuán)受到激發(fā),熒光成像的信噪比大大提高?？梢钥吹綐悠繁砻?，單分子的活動(dòng)情況。這種方法的成像裝置簡單，極易和其它成像技術(shù)、探測技術(shù)相結(jié)合，目前已成功的實(shí)現(xiàn)100nm甚至更低的空間分辨率。基本原理全內(nèi)反射熒光顯微鏡的基本設(shè)計(jì)思路全內(nèi)反射熒光顯微鏡的基本原理熒光激發(fā)原理熒光捕捉原理snell定律:n1sinθ1=n2sinθ2當(dāng)n1大于n2時(shí)，全反射就可能發(fā)生:θ2=90°θc=sin-1(n2/n1)即所有的入射

5、光線全部反射出來,稱為全內(nèi)反射全內(nèi)反射熒光激發(fā)原理沿著入射面上的介質(zhì)邊界傳播在平行界面方向以平行波場方式傳播在垂直界面方向則是呈指數(shù)衰減。隱失波的強(qiáng)度-深度圖隱失波熒光激發(fā)原理非均勻波透射強(qiáng)度和浸透深度公式T12（θi）-分界面處的透射強(qiáng)度d12-滲透深度θi-入射角λ-入射光波長隱失波對于可見光波長380～780nm而言，浸透深度為～100nm。熒光激發(fā)原理箭頭表示激光的方向，激光被全反射，同時(shí)產(chǎn)生在z方向成指數(shù)衰減的隱失波。黃色小圓點(diǎn)表示被隱失波激發(fā)的熒光分子，白色小圓點(diǎn)表示未被激發(fā)的熒光分子。熒光捕捉原理CCD相機(jī)CCD相機(jī)的高靈敏度特點(diǎn)使全內(nèi)反射熒光顯微鏡利用

6、消逝波照射樣品并使其成像成為可能，也成就了其高信噪比。CCD相機(jī)的快速成像特點(diǎn)提高了其時(shí)間分辨率，使得觀察單分子的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞物質(zhì)的分泌、蛋白質(zhì)的相互作用成為可能并成為這方面的優(yōu)勢觀察儀器。目前使用CCD探測,可達(dá)到的量子產(chǎn)率已到～80%,成像速率～200Hz.當(dāng)對活細(xì)胞成像時(shí),為了達(dá)到單分子級的靈敏度或是為了減少曝光時(shí)間,需要采用圖像增強(qiáng)器。熒光捕捉原理全內(nèi)反射顯微鏡的分型及其結(jié)構(gòu)全內(nèi)反射熒光顯微鏡根據(jù)其成像系統(tǒng)的不同可分為棱鏡型和物鏡型兩種類型兩種類型的全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像系統(tǒng)，1）為棱鏡型，2）為物鏡型。（一）棱鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡利用激光經(jīng)過棱鏡并產(chǎn)生全內(nèi)反

7、射，其消逝波照射已被熒光標(biāo)記的生物樣品，其激發(fā)光從另一側(cè)進(jìn)入物鏡并被CCD相機(jī)捕捉。棱鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡光路示意圖評價(jià)棱鏡型系統(tǒng)在實(shí)現(xiàn)上更加容易，它只需要激光光源、棱鏡和顯微鏡。在探測上，它也不容易受到入射光信號的干擾。放置樣品的空間受到棱鏡的限制。（二）物鏡型全內(nèi)反射顯微鏡收集樣品熒光信號的接收器顯微鏡的物鏡發(fā)生全內(nèi)反射的光學(xué)器件。由于細(xì)胞的典型折射率為1.33～1.38,因此要想實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射,物鏡的NA必須大于1.38。表達(dá)式為：NA=nsin（u/2）nsin（u/2）>nsinθcNA為物鏡的數(shù)值孔徑,n,u分別為物鏡的折射率(浸沒油)和