熒光(熒光顯微鏡和熒光分光光度計(jì))課件.ppt

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1、熒光技術(shù)韓東洺細(xì)胞生物學(xué)科2014-11-51熒光和熒光素利用較短波長(zhǎng)的光(激發(fā)光)照射樣品，使樣品受到高能量激發(fā)，產(chǎn)生較長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光(發(fā)射光)，用來觀察和分辨樣品中產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的成分和位置。2常見熒光素：（1）異硫氰酸熒光素(fluorescein?isothiocyanate,?FITC)（2）四乙基羅丹明?(rhodamine,?RB200)（3）四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl?rhodamine?isothiocynate,?TRITC)（4）鑭系（5）藻紅蛋白（P-phycoerythri

2、n，PE）（6）多甲藻葉綠素蛋白?（peridinin?chlorophyll?protein，PerCP）（7）碘化丙啶（?propidium?iodide，PI）3合適熒光素的選擇：具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。熒光色澤與背景色澤對(duì)比鮮明。標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性。標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、快速。安全無毒4熒光顯微鏡（fluorescencemicroscope）熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。光源濾光

3、片光路聚光器鏡頭圖像采集系統(tǒng)熒光光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)魹V色系統(tǒng)：激發(fā)濾色片：置于光源與物鏡之間，用于選擇激發(fā)光范圍，只有能激發(fā)熒光染料發(fā)光的特定波長(zhǎng)的光通過。阻擋濾色片：物鏡和目鏡之間，選擇性通過特異的熒光，呈現(xiàn)專一的熒光色彩。透射光：照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)光路5熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求（一）載玻片載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)

4、光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。（二）蓋玻片蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標(biāo)本。（三）標(biāo)本組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。（四）封裱劑封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在p

5、H8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l?pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。（五）鏡油一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。6使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng)（1）嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。（2）應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。（3）防止

6、紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。（4）檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)?省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。（6）標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間防止封

7、裱劑蒸發(fā)。（7）熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級(jí)，即“-”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確可見的熒光。“++”—可見有明亮的熒光?！?++”—可見耀眼的熒光。熒光分光光度計(jì)工作原理：由光源氙狐燈發(fā)出的光通過切光器使其變成斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光，被測(cè)的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過單色器變成單色熒光后照射于測(cè)樣品用的光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過放大器放大輸至記錄儀，激發(fā)光單色器和熒光單色器的光柵均由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)的凸輪所控制，當(dāng)測(cè)繪熒光發(fā)射光譜時(shí)，將激發(fā)光單色器

8、的光柵，固定在最適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長(zhǎng)處，而讓熒光單色器凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)，將各波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀上，所記錄的光譜即發(fā)射光譜（emissionspectrum），簡(jiǎn)稱熒光光譜。7熒光分光光度計(jì)當(dāng)測(cè)繪熒光激發(fā)光譜時(shí)，將熒光單色器的光柵固定在最適當(dāng)?shù)臒晒獠ㄩL(zhǎng)處，只讓激發(fā)光單色口的凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)，將各波長(zhǎng)的激發(fā)光的強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀，所記錄的光