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1、實(shí)驗(yàn)四沉淀法提取蛋白質(zhì)二、實(shí)驗(yàn)原理沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過(guò)程。沉淀法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用的方法。其基本原理是根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離的目的。不同溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)，溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)芤旱膒H值、離子強(qiáng)度和極性都會(huì)使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是：⑴中性鹽沉淀（鹽析法）：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。⑵有機(jī)溶劑沉淀：多
2、用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化。⑶選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。⑷等電點(diǎn)沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其他方法結(jié)合使用。⑸有機(jī)聚合物沉淀：是發(fā)展較快的一種新方法，主要使用PEG聚乙二醇作為沉淀劑。在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱(chēng)為鹽析。因?yàn)橹行喳}的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形
3、成沉淀。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)，用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以最好在低溫中進(jìn)行。蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)pH溶液中由于靜電荷為零，同種電荷間的排斥作用消失，溶解度降低。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離。由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。本實(shí)驗(yàn)將根
4、據(jù)這個(gè)原理，將牛奶的pH調(diào)整至酪蛋白的等電點(diǎn)4.7，將酪蛋白沉淀出來(lái)。酪蛋白不溶于乙醇，這個(gè)性質(zhì)被用來(lái)從酪蛋白粗制劑中將脂類(lèi)雜質(zhì)除去，得到較純的酪蛋白。酪蛋白在牛奶中的含量比較穩(wěn)定，利用這一性質(zhì)可以檢測(cè)牛奶中是否摻假。三、儀器與材料燒杯（250ml、100ml）、玻璃棒、水浴鍋、2ml、5ml、10ml移液管、離心機(jī)、磁力攪拌器、布氏漏斗、抽濾瓶、精密pH試紙或酸度計(jì)、表面皿、電子天平等。1）鹽析實(shí)驗(yàn)：飽和硫酸銨溶液、硫酸銨結(jié)晶粉末、卵清蛋白溶液500mL（5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液，新鮮雞蛋清：水=1:1，然后用六層紗布過(guò)濾。）。2）透析除鹽實(shí)驗(yàn)：
5、蛋白質(zhì)的氯化鈉溶液：三個(gè)除去卵黃的雞蛋清與700ml水及300ml飽和NaCl溶液混合后，用數(shù)層紗布過(guò)濾、10%硝酸溶液、1%硝酸銀溶液、10%氫氧化鈉、1%硫酸銅。3）等電點(diǎn)沉淀實(shí)驗(yàn)：脫脂或低脂牛奶、濾紙、pH試紙、無(wú)水乙醇、乙醚、乙酸鈉緩沖液0.2mol/L（pH4.7）[A液:0.2mol/L醋酸鈉溶液,稱(chēng)NaAC·3H2O54.44g，定容至2000ml。B液：0.2mol/L醋酸溶液。取A液1770ml，B液1230ml混合即得pH4.7的醋酸——醋酸鈉緩沖液3000ml。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.球蛋白和卵清蛋白的鹽析1）球蛋白沉淀。加卵清蛋白溶液5ml
6、于離心管中，再加15ml的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解。2）離心。將上述絮狀沉淀液以3000轉(zhuǎn)/分的速度離心8分鐘，收集上清液。3）清蛋白沉淀。向上清液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時(shí)析出的沉淀為清蛋白。取出部分沉淀清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀是否溶解。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。如球蛋白可在部分飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。另由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)降低其鹽類(lèi)濃度時(shí)，又能再溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過(guò)程。2.透析除鹽1）檢查透析袋將透析袋兩端用
7、透析夾夾緊，裝入蒸餾水，輕輕擠壓，檢查膜有無(wú)水滲出。若有水滲出，說(shuō)明有小孔，不能使用。2）裝樣透析裝透析管：取蛋白質(zhì)的氯化鈉溶液10ml，裝入透析袋，然后放在盛有蒸餾水的燒杯中。40min后，自燒杯中取水1ml，加10%HNO3溶液1滴使成酸性，再加入AgNO3溶液2滴，檢驗(yàn)氯離子的存在與否。從燒杯中取水1ml水，進(jìn)行雙縮脲反應(yīng)，檢驗(yàn)是否有蛋白質(zhì)的存在。不斷更換燒杯中的蒸餾水，加速透析過(guò)程。3）終點(diǎn)判定數(shù)小時(shí)后，從燒杯中的水中不再能檢出氯離子。此時(shí)停止透析并檢查透析袋內(nèi)容物是否有蛋白質(zhì)存在（此次應(yīng)觀察到透析袋中球蛋白沉淀的出現(xiàn)，這是因?yàn)榍虻鞍撞蝗苡诩兯木?/p>
8、故）。3.等電點(diǎn)法提取牛奶中的酪蛋白取10ml牛奶3000r/mi
