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1、抗腫瘤藥物藥效學(xué)指導(dǎo)原則一、基本原則1.抗腫瘤藥物分類(1)細(xì)胞毒類藥物():包括干擾核酸和蛋白質(zhì)合成、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶及作用于微管系統(tǒng)的藥物等;(2)生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑();(3)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑();(4)腫瘤治療增敏劑();(5)腫瘤血管生成抑制劑();(6)分化誘導(dǎo)劑();(7)生長(zhǎng)因子抑制劑();(8)反義寡核苷酸()。2.抗腫瘤藥物藥效學(xué)需研究?jī)?nèi)容2.1包括體外抗腫瘤試驗(yàn),體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)。2.2評(píng)價(jià)藥物的抗癌活性時(shí),以體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為主,同時(shí)參考體外試驗(yàn)結(jié)果以做出正確的結(jié)論。2.3I類抗腫瘤新藥應(yīng)進(jìn)行藥物作用機(jī)制
2、初步研究。二、體外抗腫瘤活性試驗(yàn)1.試驗(yàn)?zāi)康?.1對(duì)候選化合物進(jìn)行初步篩選;1.2了解候選化合物的抗瘤譜;1.3為隨后進(jìn)行的體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)提供參考,如劑量范圍、腫瘤類別等。2.試驗(yàn)方法選用10-15株人癌細(xì)胞株,根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)細(xì)胞系及適量的細(xì)胞接種濃度,按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng);推薦使用四氮唑鹽還原法、還原法、磺酰羅丹明1/12B染色法、或51釋放試驗(yàn)、集落形成法等測(cè)定藥物的抗癌作用。藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間一般為48-72小時(shí),貼壁細(xì)胞需先貼壁24小時(shí)后再給藥。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)
3、抗腫瘤藥,陰性對(duì)照為溶媒對(duì)照。3.評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以同一樣品不同濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率作圖可得到劑量效應(yīng)曲線,然后采用法計(jì)算半數(shù)有效濃度(50值或50值)。體外試驗(yàn)至少重復(fù)一次。附注:評(píng)價(jià)藥物抗癌活性的方法:1.還原法1.1基本原理:四氮唑[,3-(4,52)-2,5]是一種能接受氫原子的染料。活細(xì)胞線粒體中與相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的甲[月替](),而死的細(xì)胞則無此功能。用二甲基亞諷()溶解甲[月替]后,在一定波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值,即可定量測(cè)出細(xì)胞的存活率。1.2操作步驟:1.2.1選用對(duì)數(shù)
4、生長(zhǎng)期的貼壁腫瘤細(xì)胞,用胰酶消化后,用含10%小牛血清的l640培養(yǎng)基配成5000個(gè)/的細(xì)胞懸液,接種在96孔培養(yǎng)板中,每孔接種200μl,37℃,5%2培養(yǎng)24h。1.2.2實(shí)驗(yàn)組換新的含不同濃度被測(cè)樣品的培養(yǎng)基,對(duì)照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基,每組設(shè)3~5平行孔,37℃,5%2培養(yǎng)4~5d。1.2.3棄去上清液,每孔加入200μl新鮮配制的含0.2/的無血清培養(yǎng)基.37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清,并加入200μl,用微型超聲振蕩器混勻后,在酶標(biāo)儀上以試驗(yàn)波長(zhǎng)為570,參比波長(zhǎng)為450測(cè)定光密度值。1.3結(jié)果評(píng)定
5、:按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率:腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率%=(1-實(shí)驗(yàn)對(duì)照)×100%以同一樣品的不同濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線,從中求出樣品的半數(shù)殺傷濃度50。合成化合物或植物提取純品的50<10μg/m1或植物2/12粗提物的50<20μg/m1時(shí),則判斷樣品在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。2.生長(zhǎng)曲線法的基本原理:在最適條件下,腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈指數(shù)生長(zhǎng),如取細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間作圖可得一條直線,故稱此時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。隨著細(xì)胞密度不斷增高,由于代謝產(chǎn)物的積聚及營(yíng)養(yǎng)物的消耗,細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸減
6、慢以致停止,此時(shí)稱高坪期或穩(wěn)定期。因此藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可通過生長(zhǎng)曲線反映出來。3.染料排斥試驗(yàn)的基本原理:活細(xì)胞有排斥某些染料如伊紅、臺(tái)盼藍(lán)、苯胺黑等的能力,而死細(xì)胞由于膜完整性的破壞,可被著色。因此培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中加入這些染料,一定時(shí)間后,對(duì)著色和未著色的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),即可算出被殺死的細(xì)胞比例。4.集落形成法的基本原理:克隆原細(xì)胞具有持續(xù)增殖能力,當(dāng)單個(gè)細(xì)胞分裂6代或6代以上時(shí),其后代所組成的群體(集落)便含50個(gè)以上細(xì)胞。通過集落計(jì)數(shù)可對(duì)克隆原細(xì)胞作定量分析。它反映了單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力,故能較靈敏地測(cè)定抗癌
7、藥的活性,日前被認(rèn)為是一種較理想的檢測(cè)方法。常用的集落形成法可分為貼壁法及半固體培養(yǎng)法兩種。5.法的基本原理:(是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料,粉紅色,可溶于水。可與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合。其在515波長(zhǎng)的讀數(shù)與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。故可用作細(xì)胞數(shù)的定量。法的一個(gè)缺點(diǎn)是值可隨放置時(shí)間而變,而法無此現(xiàn)象。因此更適用于進(jìn)行大規(guī)模的試驗(yàn)。三、體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)必須選用三種以上腫瘤模型,其中至少一種為人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。試驗(yàn)結(jié)果三種模型均為有效,再重復(fù)一次也為有效,評(píng)定該化合物對(duì)這些實(shí)驗(yàn)性腫瘤具有
8、治療作用。鼓勵(lì)使用人類腫瘤裸鼠移植瘤模型和多種類的移植瘤模型、原位接種模型和中3/12空纖維測(cè)定()等方法。1.動(dòng)物動(dòng)物要求健康,符合等級(jí)動(dòng)物要求,有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證。雌雄均可,但同一批實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物性別必須相同。小鼠鼠齡為5-6周,體重為18-22克。評(píng)價(jià)同一物質(zhì)的活性時(shí),不同批次的實(shí)驗(yàn)必須采用同一品系的小鼠。2.腫瘤模型2.1小鼠腫瘤模型淋巴細(xì)胞白血病腹水瘤L