解剖小白鼠實(shí)驗(yàn).ppt

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1、細(xì)胞原代培養(yǎng)(Cellprimaryculture)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞體外培養(yǎng)的原理、基本方法，了解無菌操作方法及注意事項(xiàng)。學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況。實(shí)驗(yàn)原理用直接從機(jī)體獲得的細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過程主要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動(dòng)物體內(nèi)取出，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長(zhǎng)和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步。消化培養(yǎng)法又稱為組織消化分散法：將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，按不同濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒

2、器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器超凈臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器，除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。濾器濾器工作原理CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2。使用CO2培養(yǎng)箱應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)無菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。倒置顯微鏡

3、自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀培養(yǎng)板培養(yǎng)瓶實(shí)驗(yàn)材料2月齡的小鼠實(shí)驗(yàn)試劑（1）1640-RPMI培養(yǎng)液（2）小牛血清（3）青、鏈霉素（4）PBS液（5）5％NaHCO3（6）75％酒精實(shí)驗(yàn)步驟一、培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作（1）清洗與消毒（2）配制溶液（3）紫外線消毒（4）洗手和著裝（5）進(jìn)入無菌室實(shí)驗(yàn)步驟動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)過程圖方法與步驟（1）動(dòng)物拉椎處死（2）取肝及剪碎：剖開腹部，將肝臟取出，放入小培養(yǎng)皿中，用PBS液洗滌1次；將肝剪成1mm大小的塊，再用PBS液洗滌2次，直到液體澄清。（3）消化及分散組織塊：將上述清洗過的組織放入試管內(nèi)，加入的

4、0.25％胰蛋白酶液，完全沒過組織，置37℃水浴中消化20～30min，每隔10min搖動(dòng)一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出試管，吸去胰蛋白酶液，加?ml培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使其分散成細(xì)胞懸液，取上清液至另一試管中。（4）觀察與計(jì)數(shù)：從細(xì)胞懸液中取出1滴滴于載玻片上，顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)目。看到球型的細(xì)胞，證明消化下來細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)成功。作業(yè):1.在細(xì)胞培養(yǎng)過程中如何防止污染?無菌操作的幾個(gè)注意事項(xiàng)1、操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。2、點(diǎn)燃酒精

5、燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營(yíng)養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。3、操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺(tái)面上用品要布局合理。5、瓶子開口后要盡量保持45°斜位。6、吸溶液的吸管等不能混用。7、自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。8、在超凈臺(tái)中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。9、凡在超凈臺(tái)外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞

6、，以防止細(xì)菌落入。