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1、生工國重室菌種操作文檔2015凍干管的開啟及制作規(guī)程一、培養(yǎng)基的配制要求：1.按照菌種庫相應(yīng)要求配置培養(yǎng)基，6支液體試管（5ml/支），三角瓶4個（30-50ml/瓶），斜面5支。2.所有培養(yǎng)基配制完成后，放置于相應(yīng)的培養(yǎng)溫度和37℃無菌檢查48h。注意：有很多無機(jī)鹽的培養(yǎng)基要將能夠產(chǎn)生沉淀的鹽分開溶解（各自用10ml去離子水溶解后，再加入到主培養(yǎng)基中）二、超凈工作臺的準(zhǔn)備1.將新潔爾滅原液稀釋50倍，噴到臺面上，或者紗布浸濕后擦拭臺面，或者用75%的乙醇擦拭或者噴灑（注意不要開火）。2.開紫外燈照射20-30min。3.關(guān)閉紫外燈，開啟風(fēng)機(jī)，10分鐘以上。4.在開始接種前，用75
2、%酒精棉擦拭臺面，手、槍。5.可以在臺面上鋪一塊滅菌的紗布。三、凍干管的開啟1.凍干管的開啟：一般有滴水法和砂輪打磨法。從DSMZ買來的雙層菌種管需要用滴水方法，從國的有些庫購買的，或NRRL得到的菌種管很細(xì)，滴水法很難打開，因此，需要用砂輪打磨。滴水法：用酒精棉擦拭菌種管，尖頭稍傾斜向下（以防菌種滾落到前面燙的區(qū)域致死，重要！），用酒精燈的外焰燒烤菌種管的前端，約1min后，用無菌水快速滴加到菌種管上，此時，管上會有裂縫，繼續(xù)靠火操作，用無菌鑷子輕敲破碎處，將菌種管打開。砂輪打磨法：用玻璃砂輪在菌種管的一側(cè)反復(fù)打磨，出現(xiàn)痕跡。接著，將該處在火上灼燒滅菌。將一無菌牛皮紙包在菌種管上
3、，反方向用力掰斷。2.菌種的復(fù)水：將液體培養(yǎng)基吸取0.5-1ml左右（視菌體量多少而定，厭氧菌加0.5ml），充分水化后，吸取100ul左右到第一支試管中（第二支和第三只分別稀釋100倍和1000倍），100ul到斜面上，晃動使其均勻分布，也可以用無菌接種針涂布均勻。如有多余的凍干液，則接200ul左右至搖瓶中。有些菌要求的初始菌液濃度比較大，因此需將凍干液全部接種到液體試管中。剩余的凍干液用EP管裝好，放置于4℃冰箱中，以備不測。開啟凍干管需要準(zhǔn)備的器材：無菌水、培養(yǎng)基、黃藍(lán)槍頭、紗布、EP管四、傳代培養(yǎng)從菌種庫接出來的一般稱為第一代，第一代其生長可能同正常的菌不一樣，會出現(xiàn)延滯
4、期延長等現(xiàn)象，因此如果一個菌出現(xiàn)長時間不長的現(xiàn)象，可以延長等候時間，直至過了其2-3個生長期后仍不長，可判斷菌種死亡。因此所有保種的菌必須用第二代或第三代來保種。生工國重室菌種操作文檔2015第一代菌體進(jìn)行染色、涂片，對圖片資料進(jìn)行保存。五、凍干管制作保護(hù)劑——脫脂牛奶的制作：大多數(shù)的菌種都可以用脫脂牛奶作為保護(hù)劑，但DSM1616等屬的微生物需要用蔗糖和明膠作為保護(hù)劑。初始菌種如果呈現(xiàn)米色塊狀，一般是用牛奶做保護(hù)劑的，如果呈現(xiàn)透明狀，則可能是使用明膠蔗糖或DMSO做保護(hù)劑的。a、用藍(lán)蓋瓶裝20-30ml水，121℃，30min滅菌。b、在無菌室取2-3g脫脂奶粉（BD），（10%
5、的濃度），在無菌室中加入到藍(lán)蓋瓶中，溶解完全，蓋好蓋子，115℃15min滅菌。將滅菌好的牛奶涂布在肉湯培養(yǎng)基平板上，37℃檢查48h，驗證無菌后待用。牛奶放4℃冰箱中。1.凍干管一般用斜面，如果斜面生長不理想，或者厭氧菌，則可以用菌液離心后的沉淀來保種。2.正常傳代，菌種長至對數(shù)生長期。將待保種的菌體涂片檢查，圖片資料進(jìn)行保存。3.斜面：取出新鮮斜面兩支，如果菌苔較厚，則吸取1ml牛奶到EP管中，用接種環(huán)刮取菌苔，到牛奶中，混合均勻，蓋好蓋子，用振蕩器混勻。如果菌苔較薄，無法刮取，則吸取牛奶液到斜面中，用接種環(huán)將菌體刮到牛奶中，再用長針頭吸出。菌液：將新鮮菌液吸取無菌離心管中，離
6、心沉淀，加入牛奶，長針頭吸出。牛奶菌懸液的濃度一般在1億個/ml。4.將混合好的菌液用長針頭吸出到凍干管中，凍干管事先用紙塞子塞好。全部做好后，用八層紗布扎好，每5-6只扎一起。5.菌體預(yù)凍：將制作好的凍干管先放在4℃，2h后轉(zhuǎn)入-20℃，2h后轉(zhuǎn)入-80℃。多數(shù)細(xì)菌可以直接凍到-80℃，兩小時或者過夜之后，上凍干機(jī)。制作凍干管需要準(zhǔn)備的器材：菌種、凍干管、長針頭、大小紗布、牛奶、肉湯培養(yǎng)基（可以用LB培養(yǎng)基取代）、接種針、槍頭、EP管六、凍干機(jī)的使用：a、將真空泵和凍干機(jī)之間的接頭打至垂直，將真空泵預(yù)熱。b、將凍干機(jī)的冷凍腔開關(guān)打開，待降至-52℃時，將樣品放置在冷凍腔中，接頭打
7、至平行。c、抽干8h以上，可過夜。d、接頭打至垂直，放氣，待真空度顯示正常，取出有機(jī)玻璃罩，取出樣品，再把玻璃罩放上，抽真空。e、待真空度達(dá)到0.1Mpa時，先把白色旋鈕垂直向上，上凍干管，待凍干管全部插滿后，將白色旋鈕垂直向下，開始抽真空，約10min后，開始熱熔封。f、將所有管子熱熔封后，將真空泵和凍干機(jī)之間的接頭打至垂直，關(guān)閉真空泵，將白色旋鈕打至傾斜，開始往冷凍腔中緩慢進(jìn)氣，真空度慢慢解除。關(guān)閉凍干機(jī)。g、將凍干機(jī)前面的黑色旋鈕打開，放冷凝水。h、關(guān)閉煤氣開關(guān)
