N-病毒毒力測試實驗.doc

《N-病毒毒力測試實驗.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、致病性和毒力實驗路線NDiV小鼠毒力實驗NDiV病毒對小鼠的LD50測定NDiV病毒對小鼠的致病性測定NDiV對雞的致病性實驗NDiV對雛雞的毒力試驗雞胚平均死亡時間(MDT)試驗NDiV病毒EID50的測定NDiV毒力測試的綜合評價毒力測試技術(shù)路線前言:蟲媒病毒（Arbovirus）是指由吸血昆蟲傳播的病毒，其特點是病毒可在昆蟲體內(nèi)繁殖，但昆蟲本身不發(fā)病，昆蟲通過叮咬將病毒傳播給人、畜引起疾病，因此蟲媒病毒可以引起人畜共患傳染?。?）。套式病毒（Nidoviruses）包括了冠狀病毒（Coronaviridae）和動脈炎病毒（Arteriviridae）及羅尼病毒

2、（Roniviridae），主要感染哺乳動物、少數(shù)禽類及無脊椎動物（蝦），由于其獨特的套式轉(zhuǎn)錄機制和較長基因組（12.7~31.7bp）的特征，被認(rèn)為是最復(fù)雜的單股正鏈RNA病毒（2）。國內(nèi)，深圳市龍崗區(qū)疾控中心開展了蟲媒監(jiān)測項目，從醫(yī)院監(jiān)測點捕獲的成蚊標(biāo)本中首次發(fā)現(xiàn)昆蟲套式病毒NDiV，并應(yīng)用C6/36細(xì)胞成功地分離到NDiV病毒，是目前國內(nèi)對NDiV的研究僅有這一篇報道（3）。國外,2011年，mBio報道了首篇昆蟲套式病毒的研究（4），在科特迪瓦的原始森林的庫蚊中首次發(fā)現(xiàn)了昆蟲套式病毒，命名為Cavallyvirus（CAVV）。同年，PlOSPathogen

3、s刊登（5）同為昆蟲套式病毒的研究，病毒于2002年在越南急性腦炎病人的腦脊液中分離成功（6），在當(dāng)?shù)貛煳脴?biāo)本也分離得到，作者PhanThiNga根據(jù)病毒的分離地點將其命名為NamDinhVirus（NDiV）。由于NDiV和CAVV的宿主與分子特性相似，與套式病毒中的已有家族存在差異，故PhanThiNga將其歸類為Nidoviruses的新家族，命名為Mesoniviridae（7）。傳統(tǒng)意義的套式病毒（Nidoviruses）包括冠狀病毒（Coronaviridae）、動脈炎病毒（Arteriviridae）及羅尼病毒（Roniviridae），主要感染哺乳動

4、物、少數(shù)禽類及無脊椎動物（蝦），由于其獨特的套式轉(zhuǎn)錄機制和較長基因組（12.7~31.7kb）的特征，被認(rèn)為是最復(fù)雜的單股正鏈RNA病毒。在科特迪瓦與越南發(fā)現(xiàn)的昆蟲套式病毒填補了套式病毒存在于節(jié)肢動物的空白。目前最長的單股正鏈ssRNA+節(jié)肢動物病毒，NDiV與CAVV核酸序列長度約為20.2kb，這顯示它們可能是套式病毒中如豬生殖與呼吸綜合征病毒的短基因病毒（smallgenomes）與SARS冠狀病毒的長基因病毒（largegenomes）之間的進(jìn)化連接。目前，國外關(guān)于NDiV的研究報告僅有PhanThiNga發(fā)表的兩篇論文（5,7），國內(nèi)的研究報告有“中國國內(nèi)

5、首次發(fā)現(xiàn)NamDinh病毒”。研究程度只涉及病毒的分子結(jié)構(gòu)學(xué)領(lǐng)域。雖然該病毒曾在越南急性腦炎病人的腦脊液中分離得到，但尚未有具體的病理因果證據(jù)證明該病毒的致病性。NDiV是否為新的蟲媒病毒仍然需要進(jìn)行深入的研究與論證，后續(xù)研究將有助于我國新分離蟲媒病毒的致病性的研究，對探討病毒與人類疾病的關(guān)系，對新發(fā)病毒的危害作出更客觀的評估。NDiV毒力測試實驗步驟：1．1NDiV乳鼠腦病毒懸液制備與保存1~2日齡健康乳鼠（昆明品系），腦內(nèi)接種NDiVC6/36細(xì)胞病毒懸液0.02mL/只，在有紗窗設(shè)備的動物房中飼養(yǎng)。逐日觀察乳鼠是否發(fā)?。ㄈ绯霈F(xiàn)散窩、抽搐、弓背等癥狀），于瀕臨死

6、亡時無菌解剖取出鼠腦。加無血清的DMEM培養(yǎng)液在冰浴中研磨成漿，12,000rpm離心10min，凍存管分裝，液氮凍存?zhèn)溆谩?.2NDiV病毒株的獲取途徑（8）1.2.1NDiV病毒在細(xì)胞中傳代利用C6/36細(xì)胞，模擬自然界中NDiV病毒在宿主C6/36細(xì)胞中傳代，同時在C6/36細(xì)胞中連續(xù)傳代。用已定量的病毒采用高感染復(fù)數(shù)(MOI)＜0.01的病毒懸液分別接種C6/36，逐日觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)CPE達(dá)到最佳時，冰凍于-30℃冰箱中破裂細(xì)胞，然后放置37℃環(huán)境下解凍，低速離心，通過0.22μm的過濾器過濾，收集上清液感染下一代細(xì)胞，如此培養(yǎng)數(shù)代細(xì)胞病毒。余下的上清

7、液標(biāo)記編號置于-70冰箱凍存?zhèn)溆谩?.2.2NDiV病毒滴度的測定（9）根據(jù)傳統(tǒng)的空斑形成試驗測定方法，將上述收集的病毒懸液采用空斑法進(jìn)行病毒滴度測定。首先在12孔培養(yǎng)板內(nèi)常規(guī)制備BHK21和C6/36單層細(xì)胞。在冰浴中，將每代細(xì)胞病毒上清液用細(xì)胞維持液作10倍稀釋（10-1至10-8），接種各稀釋度的病毒懸液，每個稀釋度接種各2孔，每孔0.4mL，搖動12孔板，使布滿細(xì)胞層。置于37℃吸附1.0h，每隔15min搖動一次，使病毒充分吸附。吸出孔內(nèi)液體，加2%瓊脂糖覆蓋膠，每孔3.0（1.5）mL，室溫下待覆蓋膠凝固，然后細(xì)胞面朝上，置37℃孵箱中培養(yǎng)6-7d。