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1、第29卷第4期大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)V01．29No．42014年8月JOURNALOFDALIANOCEANUNIVERSITYAug．2014DOI：10．3969／J．ISSN．2095—1388．2014．04．002文章編號(hào)：2095-1388(2014)04—0329—07蝦夷馬糞海膽TLR基因cDNA克隆及表達(dá)分析王軼南，于卓，劉洋，劉學(xué)偉，王姣姣，常亞青(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)摘要：采用同源克隆和eDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)克隆獲得一條蝦夷馬糞海膽Strongylocentrotusin-termediusTL
2、R基因的全長(zhǎng)eDNA序列SiTLR一1(GenBank：HQ259110)，并采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了其在組織中的分布以及在致病弧菌V／br／ofort~、[3-D葡聚糖和dsRNA刺激后的表達(dá)情況。結(jié)果表明：SiTLR一1全長(zhǎng)序列為3637bp，形成16個(gè)0【螺旋、33個(gè)B折疊；SiTLR一1蛋白有兩個(gè)跨膜區(qū)段，在725～750位有跨膜區(qū)，發(fā)現(xiàn)1個(gè)信號(hào)肽(1～32aa)、1個(gè)亮氨酸重復(fù)富集區(qū)(ERR)；SiTLR一1在檢測(cè)的各組織中均有表達(dá)，在體腔液中表達(dá)量顯著高于圍口膜、管足和齒間肌(P<0．05)；經(jīng)fort／s、3-D一葡聚糖刺激后，體腔液中的SiTLR-1表
3、達(dá)量顯著上升，刺激后12h達(dá)到最高值；經(jīng)dsRNA刺激后，體腔液中的SiTLR一1表達(dá)變化較小，僅在3h時(shí)略有升高。研究表明，TLR基因參與蝦夷馬糞海膽的免疫應(yīng)答，克隆獲得的SiTLR一1可特異性識(shí)別細(xì)菌和B—D～葡聚糖。關(guān)鍵詞：蝦夷馬糞海膽；TLR；RACE；定量PCR中圖分類號(hào)：$917文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ATLR是一類重要的模式識(shí)別受體(patternrec—及以北沿海，在俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)也有分布，大連海ognitionreceptor，PRR)，其通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)模洋大學(xué)于1989年將其從日本引進(jìn)中國(guó)[93。本研究式分子，激活先天免疫系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥因子、抗微生中，對(duì)蝦夷馬糞海
4、膽TLR基因的克隆及其組織表物肽等，以抵御人侵病原，同時(shí)作為預(yù)警信號(hào)，向達(dá)情況進(jìn)行了研究，以期為相關(guān)研究提供參考?？乖蔬f細(xì)胞發(fā)出警報(bào)，從而啟動(dòng)獲得性免疫系1材料與方法統(tǒng)。TLR識(shí)別的信號(hào)反應(yīng)主要通過(guò)胞內(nèi)接頭蛋白髓樣分化因子88介導(dǎo)，而后NF·Kb被激活，引起1．1材料機(jī)體的天然免疫應(yīng)答，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，導(dǎo)致試驗(yàn)用2齡蝦夷馬糞海膽取自大連海洋大學(xué)農(nóng)各種不同炎性細(xì)胞因子分泌，從而在多種生物對(duì)微業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，處理前于16～生物感染的監(jiān)測(cè)和免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中起著必不可少l8c【=海水中暫養(yǎng)7d。的作用¨。近年來(lái)，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物TLR的研究正逐M—MLV反轉(zhuǎn)錄酶、E
5、XTaqDNA聚合酶、步開展，先后獲得了河豚Fugurub@、牙鲆pMD19一TVector均購(gòu)自寶生物(大連)有限公Paralichthysolivaceus、凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus司，PCR引物由該公司合成。DEPC、氨芐青霉素、vannamei4J、櫛孔扇貝Chlamysrre和刺參鈉鹽、IPTG、X—GAL、Tryptone、YeastExtract均購(gòu)Apostichopusjaponicus等的TLR基因。海膽屬棘皮自于上海生工生物工程有限公司。動(dòng)物門，在系統(tǒng)進(jìn)化中占據(jù)特殊位置，有關(guān)海膽的1．2方法免疫學(xué)研究越來(lái)越受到重視。對(duì)紫球海膽Strongy—
6、Iocentrotuspurpuratus的測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)，其存在大量1．2．1cDNA第一條鏈的合成抽取5枚健康海免疫受體基因，包括TLR_8基因家族等，但有關(guān)膽活體的體腔液混合，按照RNAprepPureTissue其他海膽TLR的研究較少。蝦夷馬糞海膽Kit總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限S．intermedius又稱中間球海膽，原產(chǎn)于日本北海道公司]方法提取蝦夷馬糞海膽體腔液總RNA。采用收稿日期：2013—11一O1基金項(xiàng)目：國(guó)家“863”計(jì)劃重大項(xiàng)目(2012AA10A412)；遼寧省教育廳項(xiàng)目(L2012263)；遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007203
7、004)作者簡(jiǎn)介：王軼南(198O一)，女，博士，助理研究員。E-mail：E-mail：wangyinan@dlou．edu．ell通信作者：常亞青(1967一)，男，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：yqchang@dlou．edu．CFI330大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)第29卷紫外分光光度計(jì)與1OL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)GAL(4Ixg／mL)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克RNA的濃度及完整性，于一80℃下保存?zhèn)溆?。隆送寶生?大連)有限公司測(cè)序。將所得序列在0．2mL的PCR管中加人100ng總RNA、1用BlastX軟件進(jìn)行同源性分
