適合豬流行性腹瀉病毒敏感復(fù)制的Vero細(xì)胞株的克隆及應(yīng)用.pdf

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1、廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年第10期105適合豬流行性腹瀉病毒敏感復(fù)制的Vero細(xì)胞株的克隆及應(yīng)用蔣智勇，蔡汝健，劉燕玲，張樂宜，李艷，宋長緒(廣東省農(nóng)科院動(dòng)物衛(wèi)生研究所／廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640)摘要：為了有效提高Vero細(xì)胞對(duì)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的易感性，采用有限稀釋法將Vero細(xì)胞進(jìn)行克隆，通過熒光定量RT—PCR方法篩選對(duì)PEDV敏感的克隆細(xì)胞。結(jié)果獲得了1株對(duì)PEDV高度易感的細(xì)胞Vero—S，該細(xì)胞株接種PEDVGZ株后培養(yǎng)3d，收獲的病毒RNA拷貝數(shù)為2．1X109copies／IxL，明顯高于Vero母細(xì)胞(3．5×1

2、0copies／IxL)。將此Vero—S細(xì)胞用于PEDV臨床樣品的分離獲得3株P(guān)EDV毒株。構(gòu)建的PEDV敏感復(fù)制的Vero—S細(xì)胞株比Vero母細(xì)胞更適合PEDV的培養(yǎng)。關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；Vero細(xì)胞；克隆中圖分類號(hào)：$859．79+7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1004—874X(2015)10—0105—04Cloningandapplication0fVerocellsforthesensitivereplicationn●●1●1●1●0IDorclneeDldemlCnlarrneaVIrUSJIANGZhi-yong，CAIRu-jian，L

3、IUYan-ling，ZHANGLe-yi，LIYan，SONGChang-xu(InstituteofVeterinaryMedicine，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences~PublicLaboratoryofVeterinarypublichealthinGuangdongProvinceGuangzhou510640，China)Abstract：ToimprovethesensibilityofVerocellstoporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)，Vcrocellswere

4、clonedbyusingthelimitingdilutionmethodandthesusceptiblecellstoPEDVwereselectedbyquantitativeRT—PCRanalysis．Inresult，oneclone，Vero-S，whichcouldreliablyproducePEDVwithhighgenomiccopynumberswasselectedfromheterogeneousVeroparentalcells．Theviralgenomiccopynumberscouldbeashighas2．1X10copi

5、es／IxLaftertheVero—ScellsinoculatedwithPEDVGZstrainfor3days．ThelevelsofviralgenomiecopynumbersinVero—ScellsweresignificantlyhigherthanthoseinVeroparentalcells(3．5×10copies／IxL)．Weisolated3PEDVstrainsfrom3pigfarmsbyusingtheVero—Scells．TheresultssuggestthattheconstructedVero—Scellsline

6、iSmoresuitabletocultivatePEDVcomparedtoVeroparentalcells．Keywords：porcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)；Verocell；cloning豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheaPED開始在我國大面積流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了virus，PEDV)屬于冠狀病毒，是有囊膜的單股正鏈巨大損失[i-2]。RNA病毒，可導(dǎo)致以嘔吐、食欲下降、水樣腹瀉、脫P(yáng)EDV在體外細(xì)胞中適應(yīng)性差，繁殖條件復(fù)雜，水和哺乳仔豬高致死率為主要特征的豬流行性腹瀉在細(xì)胞培養(yǎng)中繁

7、殖滴度低，細(xì)胞病變不明顯，這一直(porcineepidemicdiarrhea，PED)。PED在1971年首是PEDV體外增殖過程的重要技術(shù)瓶頸，直接影響次報(bào)道于英國，我國從1976年開始陸續(xù)有PED的了對(duì)該病毒生物學(xué)特性基礎(chǔ)研究及該病毒相關(guān)生物報(bào)道，并于1980年首次分離到PEDV。2010年冬季制品的發(fā)展。本試驗(yàn)采用有限稀釋法將Vero細(xì)胞進(jìn)行克隆，通過熒光定量RT—PCR方法篩選獲得了1收稿日期：2014—12—22株對(duì)PEDV敏感的克隆細(xì)胞Vero—S，從而為PEDV基金項(xiàng)目：廣東促進(jìn)科技服務(wù)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)(2010野毒株的分離、體外增殖和生物學(xué)特性研究

8、奠定了A04030101