探索運(yùn)用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋零的方法.pdf

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1、2015年4月第13卷第10期·實(shí)驗(yàn)研究·77探索運(yùn)用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋零的方法李青鞠(河南省濮陽(yáng)市濮陽(yáng)油田總醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南濮陽(yáng)457001)【摘要】目的探討運(yùn)用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋零的方法。方法以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的DNA含量、磷酯酰絲氨酸、線粒體膜電位、鈣離子濃度，對(duì)凋零細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果DNA含量檢測(cè)敏感度、特異性欠佳；磷酯酰絲氨酸測(cè)定對(duì)細(xì)胞凋零的早期、晚期情況可做出良好反應(yīng)；線粒體膜電位、鈣離子濃度可反應(yīng)出細(xì)胞凋零時(shí)的生理指標(biāo)。結(jié)論每種檢測(cè)方法均存在一定的優(yōu)缺點(diǎn)，在使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋零時(shí)，應(yīng)具有針對(duì)性的檢測(cè)方法進(jìn)行選擇，提高檢測(cè)效率。【關(guān)鍵詞】流式細(xì)胞儀；細(xì)胞

2、凋零；DNA含量；磷酯酰絲氨酸；線粒體膜電位中圖分類號(hào)：R329．2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1671-8194(2015)10-0077-02細(xì)胞凋零又稱為細(xì)胞程序性死亡，細(xì)胞凋零時(shí)，往往伴有形態(tài)變條件下進(jìn)行負(fù)載至Flou一3進(jìn)入至細(xì)胞內(nèi)部。對(duì)于未負(fù)載成功的熒光探化及生化改變。了解細(xì)胞凋零過(guò)程對(duì)于維持機(jī)體的正常發(fā)育、促進(jìn)新測(cè)劑進(jìn)行洗滌，并通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。陳代謝是具有重要意義的，細(xì)胞凋零是具有一項(xiàng)正向意義的機(jī)體內(nèi)部2結(jié)果活動(dòng)Ⅲ。但由于細(xì)胞凋零與細(xì)胞壞死之間存在大量的相似點(diǎn)，因此，2．1DNA含量檢測(cè)結(jié)果：細(xì)胞發(fā)生凋零時(shí)，可激活核酸內(nèi)切酶，致死了解一個(gè)細(xì)胞具體的凋零過(guò)程是十分有

3、必要的。目前，常通過(guò)流式細(xì)DNA出現(xiàn)斷裂。以PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，可顯示出“亞二倍峰”，及所胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋零的過(guò)程，該種儀器可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析和分謂的凋零峰。通過(guò)凋零峰，可對(duì)細(xì)胞凋零的百分率進(jìn)行計(jì)算。在此次選。在此次調(diào)查中，筆者主要從測(cè)定DNA含量、磷酯酰絲氨酸、線粒試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組應(yīng)存在LPS刺激的差異，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組DNA斷體膜電位、鈣離子濃度等方面來(lái)了解細(xì)胞凋零過(guò)程中所發(fā)生的一系列裂的發(fā)生率明顯高于對(duì)照組。因此，可通過(guò)DNA含量檢測(cè)來(lái)確定細(xì)胞生化改變特性，并篩選出檢測(cè)細(xì)胞凋零的最適方法。具體情況如下。凋零率。1材料與方法2．2磷脂結(jié)合蛋I~lAnnexinV-FITC／Pl檢測(cè)

4、法檢測(cè)結(jié)果：在細(xì)胞凋零早1．1試驗(yàn)材料：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞由上海博古生物提供，脂多糖由期，細(xì)胞膜可發(fā)生重排反應(yīng)。重排反應(yīng)可使得磷酯酰絲氨酸由細(xì)胞膜Sigma公司生產(chǎn)提供，AnnexinV-FITC／PI細(xì)胞凋零檢測(cè)試劑盒由Roch內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜表面。AnnexinV可與翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞外部的磷酯酰絲氨公司生產(chǎn)提供，JC一1、羅丹明123膜電位檢測(cè)試劑盒由碧云天公司生酸相結(jié)合，反應(yīng)細(xì)胞早期凋零時(shí)的情況。而PI中晚期凋零細(xì)胞及死亡產(chǎn)提供，F(xiàn)ulo一3鈣離子濃度檢測(cè)試劑盒由碧云天公司生產(chǎn)提供。細(xì)胞進(jìn)行染色反應(yīng)，PI作為核酸染料，可直接穿透細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞核進(jìn)1．2細(xì)胞培養(yǎng)方法：此次試驗(yàn)主要通過(guò)DMEM／

5、F12培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行行染色，使其細(xì)胞核呈紅色。因此，可通過(guò)AnnexinV-FITC／PI區(qū)分細(xì)培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)直至融合。細(xì)胞消化傳代使用1．25gm胰酶，并胞的早、中、晚及死亡期。從中選擇生長(zhǎng)良好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。2．3線粒體膜電位檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果：當(dāng)膜電位下降時(shí)，可表示細(xì)胞處于凋1．3實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的設(shè)定：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中加入20mg／L的LPS，并對(duì)零早期。當(dāng)線粒體膜電位較低時(shí)，JC一1以單體形式存在。經(jīng)檢測(cè)，此時(shí)細(xì)胞進(jìn)行一段時(shí)間的刺激。對(duì)照組細(xì)胞中不加入藥物，使兩組細(xì)胞的其所激發(fā)的波長(zhǎng)為488n／rl、發(fā)射的波長(zhǎng)為529nln，所呈現(xiàn)出的為綠色最終培養(yǎng)濃度為5×10+／m

6、L。熒光。當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC一1以聚合體形式存在。經(jīng)檢測(cè)，此時(shí)1．4試驗(yàn)方法其所激發(fā)的波長(zhǎng)為490nln、發(fā)射的波長(zhǎng)為590nln，所呈現(xiàn)出的紅橙色熒1．4．1DNA含量測(cè)定：以PBS對(duì)胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行洗滌，通常洗滌2光。因此，可通過(guò)線粒體膜電位的檢測(cè)結(jié)果反映出細(xì)胞凋零早期。此次，后收集細(xì)胞。加入預(yù)冷70％的乙醇溶液，于4℃恒溫環(huán)境下放置次試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞熒光顯示逐漸由紅橙色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色。過(guò)夜。離心法收集所需細(xì)胞，并加入5Og／mL的溴化乙錠及100咖L而羅丹明123染料是一種線粒體跨膜電位指示劑，其可直接透過(guò)的RNaseA，在4℃環(huán)境中避光培養(yǎng)30min后以流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞細(xì)

7、胞膜。當(dāng)細(xì)胞正常時(shí)，羅丹明123染劑可通過(guò)線粒體跨膜電位直接檢測(cè)。進(jìn)入線粒體機(jī)制，使得熒光強(qiáng)度明顯減弱或消失。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋零1．4．22磷脂結(jié)合蛋白AnnexinV-FITC／PI檢測(cè)法：以PBS對(duì)胰酶消化細(xì)胞時(shí)，線粒體膜可受到破壞，并可重新釋放出線粒體，熒光強(qiáng)度增加，進(jìn)行洗滌，通常洗滌2次，后收集細(xì)胞。于細(xì)胞內(nèi)加入經(jīng)FITC所標(biāo)記并主要放射出黃綠色熒光?？梢?jiàn)，羅丹明123染料檢測(cè)也可直接反映的AnnexinV，并在室溫環(huán)境下避光培