實(shí)驗(yàn)五--核酸瓊脂糖凝膠電泳.doc

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1、實(shí)驗(yàn)五核酸瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康沫傊悄z電泳是常用的檢測(cè)核酸的方法，具有操作方便、經(jīng)濟(jì)快速等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術(shù)，掌握有關(guān)的技術(shù)和識(shí)讀電泳圖譜的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下（pH8.0的緩沖液）帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中通過(guò)凝膠介質(zhì)向正極移動(dòng)，不同DNA分子片段由于分子和構(gòu)型不同，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率也不同。溴化乙錠（EB）可嵌入DNA分子堿基對(duì)間形成熒光絡(luò)合物，經(jīng)紫外線照射后，可分出不同的區(qū)帶，達(dá)到

2、分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。但是EB具有致癌性，所以我們選用無(wú)毒，高靈敏度是ExGreen染料，。此核酸染料在紫外透照儀及可見(jiàn)光透射儀上均可使用。ExGreen外觀呈紅色，與核酸結(jié)合后，可用300nm（紫外透射儀）激發(fā)。三、材料、儀器和試劑1、材料大腸桿菌中提取的質(zhì)粒DNA2、儀器電泳儀；臺(tái)式離心機(jī)；恒溫水浴鍋；微波爐；紫外透射儀；照相機(jī)或者凝膠成像系統(tǒng)3、試劑（1）50×TAE電泳緩沖液：稱(chēng)取Tris242g，EDTA37.2g，加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，加?7.1ml的醋酸，充分?jǐn)嚢?，加去離子水定容至1L，室溫保存。（2）6×電泳上樣

3、緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)、40%（W/V）蔗糖水溶液，貯存于4℃。（3）溴化乙錠（EB）溶液母液：將EB配制成10mg/mL。用鋁箔或黑紙包裹容器，貯存于室溫即可。（4）分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA：DNAMarker四、操作步驟?1、制備1%瓊脂糖凝膠(大膠用40ml，小膠用30ml)：稱(chēng)取0.7?g(0.5?g)瓊脂糖置于錐形瓶中，加入70?ml(50ml)1×TAE，瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。注意：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的2、膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽(制膠槽)洗干凈，晾干，放入制膠

4、玻璃板.取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。在冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液中加入ExGreen染料（10ml:1ul），混勻后小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開(kāi)，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中，添加??1×TAE電泳緩沖液至沒(méi)過(guò)膠板1-2㎜為止。?注意：必須保證瓊脂糖充分完全溶解，否則，會(huì)造成電泳圖像模糊不清。加熱時(shí)如膠液劇烈沸騰發(fā)泡，停止加熱。微波爐中加熱時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。倒膠時(shí)，不要產(chǎn)生氣泡，溶液溫度太高(>60℃)，會(huì)使得水分

5、過(guò)分蒸發(fā)，改變凝膠離子濃度，影響電泳效果。3、加樣：在點(diǎn)樣板或EP管中混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10?ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染。加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周?chē)哪z面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序)。注意：加樣時(shí)，要把槍頭插入到加樣孔里，但是不要插穿加樣孔底部凝膠，保證樣品盡量在加樣孔中而不外溢。4、電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60-100V，樣品由負(fù)極(黑色)向正極(紅色)方向移動(dòng)。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約

6、1cm處時(shí)，停止電泳。??5、電泳完畢后，取出凝膠6、觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。注意事項(xiàng)：1、操作時(shí)帶一次性手套，避免DNA酶污染引起DNA降解。2、及時(shí)更換電泳緩沖液，電泳緩沖液在電泳槽中存放過(guò)，多次使用后，離子強(qiáng)度降低，PH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。3、一般情況，電泳電壓<20V/cm，溫度<30℃；大分子量DNA鏈電泳，溫度應(yīng)<15℃。4、電泳前樣品勿受熱，以免引起DNA變性。5、凝膠中DNA的上量要合適，太多會(huì)引起DNA條帶模糊，太少又會(huì)引起條帶信號(hào)弱或無(wú)DNA條帶。思考題1、瓊脂糖凝

7、膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？2、如果樣品電泳后很久都沒(méi)有跑出點(diǎn)樣孔，你認(rèn)為有哪幾方面的原因？