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《實(shí)驗(yàn)二：目的基因的PCR擴(kuò)增(含結(jié)果).doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)二熱休克蛋白HSP90的PCR擴(kuò)增技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理簡(jiǎn)介聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）是體外克隆基因的重要方法，它可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)使模板分子擴(kuò)增百萬(wàn)倍以上。因此能用于從微量樣品中獲得目的基因，同時(shí)完成了基因在體外的克隆，是分子生物學(xué)及基因工程中極為有用的研究手段。常規(guī)PCR用于已知DNA序列的擴(kuò)增，具體可分為三個(gè)主要過(guò)程：一、變性。通過(guò)升高溫度使DNA雙鏈模板分子中氫斷裂，形成單鏈DNA分子，溫度為94℃，時(shí)間1min。二、復(fù)性。降低溫度使DNA單鏈分子同引物結(jié)合。溫
2、度為55℃，時(shí)間1min。三、延伸。升高溫度，在DNA聚合酶最佳活性的條件下在引物3端加入dNTP，實(shí)現(xiàn)模板的擴(kuò)增，溫度為72℃，時(shí)間2min。同時(shí)第一步變性前要在94℃下預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈完全解開(kāi)。經(jīng)過(guò)25-35個(gè)循環(huán)之后，在72℃下繼續(xù)延伸10分鐘。PCR反應(yīng)包含的七種基本成分：1）熱穩(wěn)定性DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶是最常適用的酶，商品化TaqDNA酶的特異性活性約為80000單位/mg.2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)是影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的效率與特異性的關(guān)鍵因素。3）脫氧核苷三磷酸（
3、dNTP）：標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系應(yīng)包括4種等摩爾濃度的脫氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每種dNTP的濃度一般在200-250μl之間，高濃度的dNTP對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)會(huì)起抑制作用，可能是dNTP與Mg2+螯合有關(guān)。4）二價(jià)陽(yáng)離子：一般需要Mg2+來(lái)激活熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，由于dNTP與寡聚核酸結(jié)Mg2+合，因而反應(yīng)體系中陽(yáng)離子的濃度一般要超過(guò)dNTP和引物來(lái)源的磷酸鹽基團(tuán)的摩爾濃度。Mg2+的最佳濃度為1.5mmol/L。5）維持PH值的緩沖液：用Tris-Cl在室溫將PCR緩沖液的P
4、H值調(diào)至8.3-8.8之間，標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液濃度在10mmol/L。在72℃溫育時(shí)，反應(yīng)體系的溫度將下降1個(gè)多單位，致使緩沖液的PH值接近7.2。6）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以單鏈或雙鏈形式加入到PCR混合液中，閉環(huán)DNA的及增效率略低于線性DNA。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理和基本技術(shù)。二、材料和試劑10Х擴(kuò)增緩沖液4種dNTP貯存液（20mmol/L，PH8.0）TapDNA聚合酶5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L）模板DNA瓊脂糖凝膠移液槍（0.5-10μL5
5、-50μL）槍頭實(shí)驗(yàn)操作1）將各成分加到微量離子管內(nèi)混合：10Х擴(kuò)增緩沖液2.5μl5端引物1.5μl3端引物1.5μlDDW15μldNTP2.5μlTaq酶0.1μl模板1μl1）按照以下方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增：預(yù)變性：96oC5min30個(gè)循環(huán)：95oC45min,60oC45min,72oC150min；延伸：72oC10min注：聚合反應(yīng)時(shí)間是根據(jù)靶基因的長(zhǎng)度按每分鐘聚合1000bp的速率來(lái)計(jì)算出來(lái)的。2）抽取每種擴(kuò)增樣品5-10μl，用瓊脂糖電泳來(lái)分析擴(kuò)增結(jié)果，用DNAmarker來(lái)判斷擴(kuò)增片段的大
6、小。凝膠一般用Goldview染色后觀察擴(kuò)增的量與片段大小。從陽(yáng)性對(duì)照樣品的相對(duì)分子量的目的條帶的亮度與粗細(xì)可以判斷PCR擴(kuò)增的效率；陰性對(duì)照樣品在目的條帶附近應(yīng)該沒(méi)有相應(yīng)條帶。PCR常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：對(duì)可能發(fā)生PCR過(guò)程中主要疑難問(wèn)題的解析問(wèn)題可能原因解決方法無(wú)產(chǎn)物或產(chǎn)量低模板濃度偏低或偏高電泳檢測(cè)模板濃度，調(diào)整模板用量模板降解重新制備；基因組DNA、cDNA應(yīng)小量分裝后低溫保存模板中含有抑制反應(yīng)的雜質(zhì)純化模板引物濃度不足調(diào)整引物濃度，特別是針對(duì)長(zhǎng)片段PCR引物存在二級(jí)結(jié)構(gòu)重新設(shè)計(jì)引物，避免
7、二級(jí)結(jié)構(gòu)；優(yōu)化退火溫度引物降解引物應(yīng)高濃度小量分裝，-20℃保存，避免反復(fù)凍融Mg2+濃度偏低適當(dāng)提高M(jìn)g2+濃度，從1mM到3mM以0.5mM間隔遞增，針對(duì)不同模板和引物摸索最佳Mg2+濃度dNTP降解-20℃保存，小量分裝，避免反復(fù)凍融酶純度低，擴(kuò)增效率差選用高質(zhì)量DNA聚合酶酶量不足適當(dāng)增加酶量用酶不當(dāng)針對(duì)模板、目標(biāo)片段的特選擇適當(dāng)?shù)拿?詳見(jiàn)PCR產(chǎn)品選擇指南)緩沖液失效更換緩沖液或使用預(yù)混PCR反應(yīng)體系模板變性不充分適當(dāng)延長(zhǎng)變性時(shí)間；對(duì)高GC或復(fù)雜結(jié)構(gòu)模板，提高起始變性溫度至98℃退火溫度偏高降低退
8、火溫度，應(yīng)比引物Tm低至少5℃延伸時(shí)間不足增加延伸時(shí)間，特別是針對(duì)長(zhǎng)片段PCR循環(huán)數(shù)目不夠增加循環(huán)數(shù)PCR管污染質(zhì)量可靠的PCR管通常不需滅菌，否則應(yīng)先高溫高壓滅菌處理；用過(guò)的PCR管不可清洗后重復(fù)使用PCR儀故障檢查程序和模塊溫度其他使用PCR增強(qiáng)劑體系污染設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)尋找污染源，操作時(shí)應(yīng)注意避免交叉污染非特異產(chǎn)物過(guò)多引物濃度過(guò)高適當(dāng)減少引物濃度引物序列特異性差重新設(shè)計(jì)引物Mg2+濃度過(guò)高降低Mg2+濃度，從1
