資源描述：
《血凝血抑實(shí)驗(yàn)原理.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、血凝血抑試驗(yàn)原理Master_2010_01_05.ppt1血凝血抑試驗(yàn)的重要性§是WHO對(duì)與動(dòng)物流感檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法1.有效預(yù)防動(dòng)物疫病的發(fā)生2.有效判斷動(dòng)物疫情發(fā)生的原因3.有效推動(dòng)動(dòng)物免疫程序的制定Master_2010_01_05.ppt2血凝血抑試驗(yàn)定義及原理§血凝試驗(yàn)（HA）定義：某些病毒或病毒的血凝素，能選擇性的使某種或幾種動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝（Hemagglutination,HA），也稱為直接血凝反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱血凝試驗(yàn)（HA）§血凝抑制試驗(yàn)（HI）定義：當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性
2、抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲?，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆粒或其血凝素直接接觸。這時(shí)紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細(xì)胞凝集抑制（HemagglutinationInhibition，HI）反應(yīng)，也稱為血凝抑制反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱血抑試驗(yàn)（HI）。§原理：特異性抗體與相應(yīng)病毒結(jié)合，使病毒失去凝集紅細(xì)胞的能力，從而抑制血凝現(xiàn)象?！炷康模簷z測(cè)雞群是否有病毒感染和監(jiān)測(cè)雞群的免疫狀態(tài)。Master_2010_01_05.ppt3血凝血抑試驗(yàn)定義及原理§用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鑒定：根據(jù)抗原與相應(yīng)抗體的特異
3、性中和反應(yīng)原理，給未知病毒懸液中加入已知的抗禽流感病毒陽(yáng)性血清或已知的抗新城疫病毒陽(yáng)性血清，相應(yīng)病毒便喪失了其凝集紅細(xì)胞的能力。因此，可利用從發(fā)病的雞、鴨、鵝體內(nèi)分離的病毒做HA和HI試驗(yàn)。病毒懸液能凝集紅細(xì)胞，并且能被已知的抗血清（陽(yáng)性血清）所抑制，那么該病毒即是已知陽(yáng)性血清相對(duì)應(yīng)的病毒?！旖馕觯喝缬眯鲁且哧?yáng)性血清完全抑制了未知病毒培養(yǎng)物的血凝性，那么，這個(gè)未知病毒培養(yǎng)物就是新城疫病毒；如果病毒懸液雖然能凝集雞紅細(xì)胞，但不能被雞新城疫血清所抑制，說(shuō)明不是雞新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。Master_2010_01_05.ppt4血
4、凝血抑試驗(yàn)具體步驟1.PBS液配置（舉例，各實(shí)驗(yàn)室可能方法不同）：稱取NaCl24g，Na2HPO48.7g，KCl0.6g，KH2PO40.6g，加蒸餾水至3000ml，加熱溶解后調(diào)pH值至7.2，121度高壓滅菌15min，4攝氏度保存?zhèn)溆?.1%雞紅細(xì)胞液制備（舉例，各實(shí)驗(yàn)室可能方法不同）：I.采血：采集至少3只SPF公雞（如沒(méi)有，可用常規(guī)試驗(yàn)證明體內(nèi)無(wú)禽流感和新城疫抗體的雞）的血液與等體積PBS液混合，將混合液10ml裝入帶刻度離心管II.洗滌雞紅細(xì)胞：將離心管放入離心機(jī)中，經(jīng)2000r/min，離心4-5min，棄上清液與白細(xì)胞，
5、將沉淀的紅細(xì)胞加生理鹽水洗滌，如此反復(fù)離心三次，第四次離心時(shí)2500r/min，離心5minIII.配置1%雞紅細(xì)胞：99ml生理鹽水或PBS+1ml洗滌完畢的雞紅細(xì)胞。3.血凝試驗(yàn)I.用PBS（生理鹽水）鋪板：在96孔血凝板中，每孔加入25ulPBS緩沖液。II.倍比稀釋：吸取25ul待檢樣品加入第1縱排孔中，吹打15下后吸取25ul再加入第2縱排孔，再吹打15下，吸取25ul加入第3縱排孔中，依次類推，直至第11縱排孔，吹打混勻后吸25ul棄去，第12縱排為紅細(xì)胞對(duì)照。III.加紅細(xì)胞：加1%紅細(xì)胞，每孔25微升IV.孵育：37?溫箱或
6、者室溫反應(yīng)20-40分鐘左右V.讀數(shù)：以出現(xiàn)完全凝集的孔作為病毒的血凝滴度。Master_2010_01_05.ppt5血凝血抑試驗(yàn)具體步驟血凝試驗(yàn)結(jié)果判定：1.將反應(yīng)板傾斜成45度角，沉于孔底的紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動(dòng)者為沉淀，表明紅細(xì)胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細(xì)胞平鋪孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，說(shuō)明紅細(xì)胞被病毒所凝集。2.能使雞紅細(xì)胞完全凝集的抗原的最高稀釋倍數(shù)，稱為該抗原滴度紅細(xì)胞凝集效價(jià)。如下圖第8孔紅細(xì)胞為完全凝集，說(shuō)明該抗原效價(jià)為1：256血凝試驗(yàn)主要是測(cè)定病毒的紅細(xì)胞凝集價(jià)，以確定紅細(xì)胞凝集抑制試
7、驗(yàn)所用病毒的稀釋倍數(shù)（抗原單位）Master_2010_01_05.ppt6血凝血抑試驗(yàn)具體步驟4.4單位抗原制備：根據(jù)抗原效價(jià)結(jié)果配置相應(yīng)比例的抗原稀釋液，即4單位抗原。如上圖抗原效價(jià)為1：256，HI試驗(yàn)時(shí)，25ul抗原稀釋液內(nèi)須含4個(gè)凝集單位，則應(yīng)將抗原做256/4=64倍稀釋。即取100ul抗原，加入6400ulPBS液混勻（注：有些用戶可能需要做4單位抗原校正，即驗(yàn)證4單位抗原是否配置準(zhǔn)確）5.血凝抑制試驗(yàn)I.用PBS（生理鹽水）鋪板：在96孔板中，每孔加入25ulPBS緩沖液II.倍比稀釋：吸取25ul待檢樣品加入第1縱排孔中，
8、吹打混勻，倍比稀釋至第11縱排孔，吹打混勻后吸25ul棄去，第12縱排為紅細(xì)胞對(duì)照III.加抗原：將配置好的4單位抗原加入96孔板中，每孔25ul，混勻IV.室溫靜置30minV
