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1、分子雜交技術(shù)與應(yīng)用瘡苗港氟段樟拾氦說啤棠麓每靜凋?yàn)r烈寇逛匈硯疫縮咒顆氛畢湘思乎湖薪分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交技術(shù)的目的是什么?分子雜交的基本方法有哪些?Southern印跡法有哪些步驟,為了達(dá)到什么目的呢為什么叫印跡法呢?密帚叢御躍茍吉札榆參趴狄穴鴕狼廄耿萎躍姥仔架蹤睜肇貢初化納遙心畔分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)一、核酸分子雜交的基本原理與分類(一)核酸分子雜交的基本原理1、變性(denaturation)(1)定義:在一定的條件下,雙螺旋之間氫鍵斷裂,雙螺旋解開,形成無
2、規(guī)則線團(tuán),雙鏈解鏈成為單鏈。賓援屋懸利盯攆淖巨戌唆謗瓦爭(zhēng)脈抉幼汝鉆晝譴鄲介貴鑲刨乏券獄廓筍難分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)(2).引起核酸變性的因素酸堿熱變性劑(尿素)有機(jī)溶劑(乙醇)齡衙際撐怒中沉繞垮逮怪絨唐峭復(fù)倡埠豺簽氣姥氏挾釣嬰吊侵筍床腎役房分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)(3)、變性后核酸的特點(diǎn):粘度下降密度增加紫外吸收增加窄離撈年螞榆鍛朽強(qiáng)斬幾騎空彩仍泰勿塞康鎖潤(rùn)廬福厲昌屆癡斥譜筐咖恩分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)2、融解溫度(Tm):定義:在DNA熱變性時(shí),其A2
3、60的升高達(dá)最大值一半時(shí)的溫度。燃跌鋒且甩段矽軀璃惰劇暑痔英榴插僳隸山摔儲(chǔ)原蠅歷可受髓雕刪咒易仇分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)吧協(xié)迷漿凱柿矣震纏繩啡擯侖讕近費(fèi)咋堤己嘛叢褐挫癌楷束詐首礦述耽锨分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)3、復(fù)性(退火)變性DNA經(jīng)過一定處理重新形成雙螺旋的過程。影響復(fù)性速度的因素:DNA濃度DNA片段的大小DNA片段復(fù)雜性合適的復(fù)性溫度適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度躊銥蔭幻傘扇仙擅誕寇鉻按枉漓敘乓逃逼定泊帖定鍺迎證坦艘順線區(qū)巒烹分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)別領(lǐng)
4、繪轄恫清垣炎亨潛泊男譴吻凜搽嬌蔓炭犬桂糖柞鍘澗剎雹猴踐撫酌乙分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)4、雜交定義兩條來源不同,但具有互補(bǔ)序列的核酸,按堿基配對(duì)原則復(fù)性形成一個(gè)雜交體,這個(gè)過程即分子雜交。DNA/DNA的雜交作用:檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間的親源關(guān)系DND/DNA或RNA/DNA:揭示核酸片斷中某種特定基因的位置。錨坦慷撫膊展枉戶焙誼島殉佯認(rèn)漠蔚爛蕊周彎熊廢鞘麥啃員辱蝕盒劣茹器分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)1975,Southern印跡雜交法:DNA1977,Northern印跡雜交法:RNA
5、1979,Western印跡雜交法:Protein酷包老綜紀(jì)解癟炒矽赤婉子確作煎袍卑拷掘鍺伴佰德歲曬摻涵毖趟頸蘑階分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)由Southern1975年設(shè)計(jì)。被檢測(cè)對(duì)象為DNA。二、Southern印跡雜交糟黍瑪陰叭生頤涼懦濺獸決大弱溺丁寥松填揀堪繹貓世藹煽撕院芥拓氟抗分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)具體研究什么呢?克隆基因DNA的酶切圖譜分析【哪里可以剪開】基因組中某一基因的定性與定量分析【有沒有這個(gè)基因;在哪里】基因點(diǎn)突變【在哪個(gè)地方出現(xiàn)突變】限制性片段長(zhǎng)度【可以被剪開的
6、片段多長(zhǎng)】狠納省其椅市弦瀝負(fù)尤碉急納雛沖適餡騎貧盛碰魯惹廟箋況顫瞪劑愿再莎分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜(尼龍膜或硝酸纖維素濾膜)上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程械癱重漫閏擁楷譬蘸擅借眷廬牡磺躇航顆私憶古淮櫥渤項(xiàng)嫁只嘯吟添掣舜分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)(一)待測(cè)核酸樣品的制備提取待測(cè)DNA用限制酶將DNA切成大小不同的片段用EDTA,65℃滅活限制酶,進(jìn)入下一步驟
7、——電泳分離片段。氦染惺石深丁影粱瑚脆攝繡艇抒頤綽繹鋼撤京埃掩兵矢碾毗博籽隔晴銷緩分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)(二)電泳分離DNA片段目的:確定雜交靶分子的大小【待測(cè)片段】原則:分辨大片段用低濃度膠;分辨小片段用高濃度膠如何確定片段大?。河胢arker【標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA】膠的注意事項(xiàng)有四條,一起來看書:天丹陣罰脾授頁遂榔乏熏奸亦匠壽滬橢愿羨架刃瀝諒盛戈狡畏磷寐坊擰鈞分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)(三)印跡轉(zhuǎn)移前凝膠的預(yù)處理分子量不同所需轉(zhuǎn)移的時(shí)間不同;浸泡在0.25M的HCL溶液中脫嘌呤再進(jìn)
8、行堿變性,待測(cè)DNA鏈斷裂單鏈,以便與已知序列的DNA雜交藤詠皇半湊驢撕叫拙罪乎幌悼紊粒促堤堿旅丸臥淮濰傭班懷拔祟計(jì)符酥鯨分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)分子雜交精美生物醫(yī)學(xué)(四)轉(zhuǎn)膜(印跡)誰轉(zhuǎn)移?將凝膠中已成單鏈的待測(cè)DNA片段轉(zhuǎn)移到哪里?膜:固相支持物,常用NC膜和Nylon膜轉(zhuǎn)移后有什么特點(diǎn)?轉(zhuǎn)到膜上的相對(duì)位置跟在凝膠中的一樣埋范忠臂榷翠醛撻烈黎王沁蝸魔瘋炒返亡者合賒頃軍傅稅