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1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和重組子的篩選與鑒定姓名:鄭小煜學(xué)號:9班級:11級生技班同組者:趙莉、高瑞【實驗?zāi)康摹?、學(xué)習(xí)在實現(xiàn)DNA的體外重組過程中,正確選擇合適的載體和限制性內(nèi)切酶,并利用限制性核酸內(nèi)切酶對載體和目的DNA進行切割,產(chǎn)生利于連接的合適末端。2、通過對DNA的酶切,學(xué)習(xí)設(shè)計構(gòu)建重組DNA分子的基本方法,掌握載體和外源目的DNA酶切的操作技術(shù)。3、學(xué)習(xí)利用T4DNA連接酶把酶切后的載體片段和外源目的DNA片段連接起來,構(gòu)建體外重組DNA分子的技術(shù),了解并掌握幾種常用的連接方法。4、掌握利用CaCl2制備感受態(tài)細胞的方法。5、學(xué)習(xí)并掌握熱擊法轉(zhuǎn)化E.coli的原理和方
2、法。6、在使用紅白菌落法篩選獲得重組子的基礎(chǔ)上,本實驗學(xué)習(xí)通過對重組子進行重組質(zhì)粒DNA的抽提鑒定,以進一步確定重組質(zhì)粒中含有外源目的DNA片段,驗證重組子是期望的重組子的方法。7、通過學(xué)習(xí)掌握重組DNA分子鑒定的基本方法。8、掌握α互補篩選法篩選重組子的方法。并鑒定體外導(dǎo)入目的DNA片段的大小。9、學(xué)習(xí)用試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA的方法。10、復(fù)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的原理及方法?!緦嶒炘怼客庠碊NA與載體分子的連接即為DNA重組技術(shù),這樣重新組合的DNA分子叫做重組子。重組的DNA分子在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中,將分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的載體
3、分子和外源DNA分子連接起來。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細胞中,將轉(zhuǎn)化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng),可以通過α互補篩選法篩選出重組子,并可通過酶切電泳及PCR檢驗的方法進行重組子的鑒定。1、限制性核酸內(nèi)切酶及酶切反應(yīng)體外構(gòu)建重組DNA分子,首先,要了解目的基因的酶切圖譜,選用的限制性內(nèi)切酶不能目的基因內(nèi)部有專一的識別位點,即當(dāng)用一種或兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割外源供體DNA時,能得到完整的目的基因。其次,要選擇具有相應(yīng)的單一酶切位點的質(zhì)?;蛘呤删w等載體分子作為克隆的載體。常用的酶切方法有雙酶切法和單酶切法兩種。本實驗采用單酶切法,即只能用一種限制性核酸內(nèi)切酶切割目的DNA片段,酶切
4、后的片段兩端將產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端。選擇具有相同限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的合適載體,在構(gòu)建重組分子時,除了形成正常的重組子外,還可能出現(xiàn)目的DNA片段以相反方向插入載體分子中,或目的DNA串聯(lián)后再插入載體分子中,甚至出現(xiàn)載體分子自連,重新環(huán)化的現(xiàn)象,因此重組效率較低。單酶切法簡單易行,但后期篩選工作比較復(fù)雜。各種限制性核酸內(nèi)切酶都有其最佳反應(yīng)條件,其中最主要的因素是反應(yīng)溫度和緩沖液的組成,為了實驗中的方便,根據(jù)離子強度可將各種酶的緩沖液分為三類:高鹽、中鹽和低鹽離子強度緩沖液。在雙酶切體系中,限制性內(nèi)切酶在使用時應(yīng)遵循“先低鹽后高鹽,先低溫后高溫”的原則進行反應(yīng)。酶切與
5、連接是兩個密切相關(guān)的步驟,要達到高效率的連接,必須酶切完全,酶切的DNA數(shù)量要適當(dāng)。另外,酶切反應(yīng)的規(guī)模也取決于需要酶切的DNA的量,以及相應(yīng)的酶量。一般的,酶切0.2~1.0μg的DNA分子時,反應(yīng)體積約為15~20μL,DNA的量增大,反應(yīng)體積可按比例適當(dāng)放大。酶的用量參照標準:一個標準單位(U)酶能在指定的緩沖液系統(tǒng)和溫度下,1h完全酶解1μgpBR322DNA。如果酶活力低,可以適當(dāng)增加酶的用量,但是最高不能超過反應(yīng)總體積的10%,因為限制性核酸內(nèi)切酶一般是保存在50%甘油的緩沖液中,如果酶切反應(yīng)體系中甘油的含量超過5%,就會抑制酶的活性。2、載體與外源DNA的連接反
6、應(yīng)在基因工程操作中,連接反應(yīng)總是緊跟酶切反應(yīng),外源DNA片段與載體分子連接的方法即DNA分子體外重組技術(shù)主要依賴于限制性核算內(nèi)切酶和DNA連接酶催化完成的。DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-OH間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的DNA連接酶是來自T4噬菌體的T4DNA連接酶,該酶需要ATP作為輔助因子。它可以連接黏性末端和平末端。連接反應(yīng)時,載體DNA和外源DNA的摩爾數(shù)之比控制在1:(1~3)之間,可以有效地解決DNA多拷貝插入的現(xiàn)象。反應(yīng)溫度介于酶作用速率和末端結(jié)合速率之間,一般是16℃,用常用的連接時間為12-16h。本實驗的連接反應(yīng)方式是互補
7、粘性末端DNA片段之間的連接:當(dāng)載體和外源DNA用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割時,產(chǎn)生相同的黏性末端,連接后形成的重組DNA分子仍保留原限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列。若外源DNA插入片段和適當(dāng)?shù)妮d體存在同源黏性末端,這將是最方便的克隆途徑。但是,在同黏性末端連接方案中,存在高背景和兩向插入的弊端。如果用兩種能夠產(chǎn)生相同的黏性末端的限制性核酸內(nèi)切酶(同尾酶)切割時,雖然也可以有效地進行連接,但是獲得的重組DNA分子一般是消失了原來用于切割的那兩種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列,這樣不利于從重組子上完整地將插入片段