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《酪氨酸抑制性測定實驗方案.doc》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、熟地黃提取液對酪氨酸酶的抑制作用研究一、儀器和藥品:儀器:分光光度計、微量移液器(1ml)、電子天平、容量瓶(10ml、50ml、250ml)>回流裝置一套、沸石、抽濾裝置、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、水浴恒溫箱、燒杯和量筒若干。藥品:熟地黃粉末(約50g)、體積分數(shù)50%的乙醇(200ml)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、L-酪氨酸、酪氨酸酶、去離子水若干。二、實驗方案:A、熟地黃有效成分的提取:1、干燥熟地黃粉末10.0g+體積分數(shù)50%的乙醇1OOmL,室溫浸泡24ho2、燒瓶+沸石+上述浸泡液,回流提取3h,冷卻后抽濾取濾液。殘渣再次加50%乙醇100mL回流提取3h,冷卻抽濾取濾液,
2、合并兩次濾液。(回流溫度約80°Co)3、將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60-65°C濃縮回收溶劑,得膏狀提取物。4、稱取適量膏狀提取物+去離子水配置成1mg/mL溶液備用。B、磷酸緩沖溶液(PBS)的配制:1、稱取磷酸氫二鈉13.3984g,加去離子水溶解,轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中定容得a液;另稱取磷酸二氫鈉6.9011g,加去離子水溶解,轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中定容得b液。2、分別移取a、b兩溶液各50mL至250mL容量瓶中,加去離子水定容,即得pH=6.8的磷酸緩沖溶液。C、L.酪氨酸溶液和酪氨酸酶溶液的配制:1、WL-酪氨酸25.6g,用PBS緩沖液定容于50mL容量瓶
3、中,即得L-酪氨酸溶液。2、稱取酪氨酸酶0.3502g,用PBS緩沖液定容于10mL容量瓶中,即得酪氨酸酶溶液。(冰水浴中操作、保存。)D、酪氨酸酶活力的測定:(分光光度法測A475)用微量移液器分別按表一劑量準確移取a、b、c、d四組樣液,置于37°C水浴中恒溫10min后,各加入0.40mL酪氨酸酶溶液,混勻,37°C溫育反應10min,迅速移入比色皿中,測得在475nm處的吸光度A,、Ab、A。、Aa,然后按下面的公式計算熟地提取液對酪氨酸酶的抑制率:抑制率=[1.(Ad-Ac)/(Ab-Aa)]X100%表一反應液的組成(單位:ml)待測液abcdL-酪氨酸0.0
4、00.800.000.80水*/提取物0.80*0.80*0.800.80PBS緩沖液1.400.601.400.60酪氨酸酶0.400.400.400.40合計2.602.602.602.60其中:a:既無底物也無提取物的待測液;b:有底物但無提取物的待測液;C:無底物但有提取物的待測液;d:既有底物也有提取物的待測液。!1E、擴展研究:(測定不同濃度提取物對酶的抑制作用影響)保持待測液各組分一樣,僅僅是加入不同濃度的提取物,讀取從開始2min后在475nm處的吸光度A,每分鐘讀取一次。以每分鐘A475增加。.。。1為一個酶活力單位,酶促反應速度則用每分鐘A475增加值
5、來表示。