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1、第三章生物材料的預(yù)處理、細(xì)胞破碎和液-固分離第一節(jié)生物材料的預(yù)處理第二節(jié)細(xì)胞破碎第三節(jié)液-固分離第一節(jié)生物材料的預(yù)處理一、確定預(yù)處理方法的依據(jù)二、動物材料的預(yù)處理三、細(xì)胞培養(yǎng)液的預(yù)處理1.生物活性物質(zhì)存在方式與特點(diǎn)—胞外：多數(shù)微生物酶如淀粉酶、蛋白酶、糖化酶常大量存在于胞外培養(yǎng)液中。而合成酶類、代謝酶類、遺傳物質(zhì)和代謝中間物則存在于細(xì)胞內(nèi)，如DNA聚合酶、細(xì)胞色素C等。微生物酶是指起著催化作生物體系中特定反應(yīng)的、由微生物活細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。作為催化劑的微生物酶，它可以加速三種反應(yīng)：水解反應(yīng)、氧化反應(yīng)和合成反應(yīng)。一、確定預(yù)處理
2、方法的依據(jù)1.生物活性物質(zhì)存在特點(diǎn)組成復(fù)雜，含量低（見后頁)分離純化難:目的物與雜質(zhì)的理化性質(zhì)如溶解度、分子量、等電點(diǎn)等都十分接近，所以分離、純化比較困難。容易失活（1）胰島素是治療糖尿病的特效藥，胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，胰島素在胰臟中的含量為0.02％，100Kg胰腺只能提取4-5g（50-60），其產(chǎn)量之低和價格之高可想而知。將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g胰島素！大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)不但解決了這種比黃金還貴的藥品產(chǎn)量問題，1982年美國一家公
3、司用基因工程手段生產(chǎn)胰島素，生產(chǎn)成本降低30-50%。（2）人類的生長激素是由191個氨基酸相連、分子量約22000的一種蛋白質(zhì)。這種激素在幼年時分泌不足造成侏儒癥，分泌過多造成巨人癥，成年時分泌過多導(dǎo)致肢端肥大癥等。過去從死人腦垂體提取作藥用，治療一個侏儒病人約需600具尸體的腦垂體，量少價昂。1979年美國一家基因公司成功地把人的基因移入大腸桿菌生產(chǎn)出生長激素，每升工程菌液含生長激素2.4mg，治療一例病人只需100多升菌液。目前已開始人工生產(chǎn)并進(jìn)入臨床應(yīng)用試驗(yàn)。2.后續(xù)操作的要求一般要求：濾液澄清、pH適中、有一定的濃
4、度不同后續(xù)操作有不同的要求離子交換---高價無機(jī)離子、澄清度等嚴(yán)格控制溶劑萃取---蛋白質(zhì)含量較低，防乳化3.目的物穩(wěn)定性不穩(wěn)定的：要防失活青霉素---pH4.8-5.2，低溫蛋白類---高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的：可采用較劇烈的變性和處理?xiàng)l件，沉淀雜質(zhì)蛋白.如：鏈霉素，1943年美國S.A.瓦克斯曼從鏈霉菌中析離得到，是繼青霉素后第二個生產(chǎn)并用于臨床的抗生素。它的抗結(jié)核桿菌的特效作用，開創(chuàng)了結(jié)核病治療的新紀(jì)元。鏈霉素穩(wěn)定性較好，可在pH2.8~3.2，75℃加熱處理，提高過濾速度。鏈霉素為白色無定形粉末，有吸濕性。易溶于水，不溶于大多
5、數(shù)有機(jī)溶劑，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下不穩(wěn)定。二、動物材料的預(yù)處理絞肉機(jī)絞碎:提取蛋白質(zhì)和酶勻漿和組織搗碎:一些胞內(nèi)產(chǎn)物不能有效地提取，須通過特殊的勻漿才行。在實(shí)驗(yàn)室常用的是玻璃勻漿器和組織搗碎器，工業(yè)上可用高壓勻漿泵。三、細(xì)胞培養(yǎng)液的預(yù)處理為什么需要預(yù)處理？可溶性粘膠狀物質(zhì)：雜蛋白、不溶性多糖等粘度增加、影響提取操作無機(jī)鹽在采用離子交換提取時，會影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量。（1）加入凝聚劑凝聚作用：指在某些電解質(zhì)作用下，使膠體粒子的擴(kuò)散雙電層的排斥電位降低，破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒子聚集的過程。某些無機(jī)鹽可使細(xì)胞、細(xì)胞
6、碎片和蛋白質(zhì)等膠體顆粒發(fā)生凝聚作用而被去除。1.細(xì)胞及蛋白質(zhì)的處理膠體粒子穩(wěn)定的原因：帶同種電荷靜電排斥作用表面水化作用，形成水化層無機(jī)鹽促凝聚作用：加入相反電性電解質(zhì)，中和膠體表面電荷，降低了雙電層的排斥力無機(jī)鹽在水中的水化作用，破壞了膠粒水化層影響凝聚作用的主要因素有無機(jī)鹽的種類、化合價以及無機(jī)鹽的用量等。通常培養(yǎng)液中細(xì)胞或菌體帶負(fù)電荷，常采用高價陽離子促其凝固。陽離子對帶負(fù)電荷的膠粒凝聚能力的次序?yàn)椋篈l3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+常用的凝聚劑有：Al2(SO4)3·18H2O、AlC
7、l3·6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。（2）加入絮凝劑絮凝劑：有機(jī)高分子，易溶，鏈長，活性功能基團(tuán)多絮凝作用：當(dāng)往膠體懸浮液中加入絮凝劑時，膠?？蓮?qiáng)烈吸附在絮凝劑表面的功能團(tuán)上，而且一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的顆粒的表面上，形成架橋聯(lián)接，形成粗大的絮凝團(tuán)沉淀出來，有助于過濾。影響因素：分子量：大，效果好；過大，溶解度↓用量：低濃度增加用量有助架橋，濃度過高吸附飽和失去架橋作用，降低了效果。pH：影響功能團(tuán)電離度，電離度↑，鏈伸展，效果↑操作條件：攪拌：初期，快好；后期，會破壞絮凝團(tuán)（3）變性作用
8、天然蛋白質(zhì)分子受到某些物理因素（如熱、紫外線照射、高壓和表面張力等）、化學(xué)因素（如有機(jī)溶劑、脲、胍、酸、堿等）影響時，生物活性喪失，溶解度降低，不對稱性增高以及其他的物理化學(xué)常數(shù)發(fā)生改變。用途：雜蛋白質(zhì)變性沉淀析出方法：加熱、大幅度改變pH，加有機(jī)溶劑、重金屬鹽或表面活性劑（4）吸附方法：
