內(nèi)標(biāo)2教程文件.ppt

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1、內(nèi)標(biāo)2目錄定量方法外標(biāo)定量法內(nèi)標(biāo)定量法外標(biāo)定量法與內(nèi)標(biāo)定量法優(yōu)缺點(diǎn)我們公司為什么使用外標(biāo)定量，而不是內(nèi)標(biāo)定量什么是內(nèi)標(biāo)內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)外源性內(nèi)標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)總結(jié)定量方法外標(biāo)定量和內(nèi)標(biāo)定量定義？外標(biāo)定量法外標(biāo)定量法是將樣本和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品在兩個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行，通過(guò)不同濃度梯度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而對(duì)樣本內(nèi)起始模板濃度進(jìn)行定量分析。外標(biāo)定量法是在獲得已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品和未知濃度樣本Ct值后，繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣本的Ct值來(lái)確定樣本的其實(shí)模板濃度。內(nèi)標(biāo)定量法內(nèi)標(biāo)定量的方法是在待測(cè)樣品中加入已知拷貝數(shù)的的內(nèi)標(biāo)，同樣通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定樣本的起始拷貝數(shù)。數(shù)學(xué)

2、計(jì)算公式：[QS](2△CT)QS………………………內(nèi)標(biāo)濃度△CT……………………內(nèi)標(biāo)與樣本CT值的差外標(biāo)定量法與內(nèi)標(biāo)定量法優(yōu)缺點(diǎn)外標(biāo)定量法難以排除假陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；內(nèi)標(biāo)定量法雖然可以排除假陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是PCR反應(yīng)變成雙重PCR反應(yīng)后，無(wú)法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)，因此國(guó)內(nèi)大部分廠家都采用外標(biāo)定量法。我們公司為什么使用外標(biāo)定量，而不是內(nèi)標(biāo)定量?jī)?nèi)標(biāo)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的影響若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，雖然可以監(jiān)測(cè)假陰性，但是PCR反應(yīng)變成雙重PCR，根據(jù)KeLD等人的研究，雙重PCR反應(yīng)中存在存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板起

3、始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無(wú)法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：（1）Ct值的高度重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放

4、大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。（2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。美國(guó)Texas大學(xué)的科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。AppliedBiosystems公司的7700型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是全球公認(rèn)的熒光定量PCR的金標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)多色熒光同時(shí)

5、檢測(cè)，但定量檢測(cè)仍然采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，而不用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。綜上所述，利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。什么是內(nèi)標(biāo)來(lái)源特性內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)外源性內(nèi)標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)定義：為一個(gè)出現(xiàn)在每一個(gè)試驗(yàn)樣本中的特定RNA和DNA。通過(guò)使用內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)這種主動(dòng)性參比，對(duì)于加入到每一個(gè)反應(yīng)中的總RNA量的差異，其可以校正靶mRNA的定量。外源性內(nèi)標(biāo)定義：為一個(gè)以已知濃度加入至每個(gè)樣本中的特性確定的RNA和DNA,外源性主動(dòng)參比通

6、常為體外構(gòu)建的，可作為內(nèi)陽(yáng)性質(zhì)控以鑒別有PCR抑制所致的假陰性。外源性參比也可用來(lái)校正樣本或cDNA反轉(zhuǎn)錄的合成效率。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)指的是人為構(gòu)建的可與待測(cè)樣本模板競(jìng)爭(zhēng)Taq酶、dNTP和引物標(biāo)準(zhǔn)品。本公司主要是指競(jìng)爭(zhēng)相同的引物。構(gòu)建方法：將目的擴(kuò)增片段進(jìn)行突變、刪除（缺失）、插入一小段序列。使得在熒光PCR中，探針的結(jié)合區(qū)域有所差異。非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)是指人為構(gòu)建的不與待測(cè)樣本競(jìng)爭(zhēng)引物，而是從新設(shè)計(jì)一段引物?？偨Y(jié)通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)證明外標(biāo)法加入適量的內(nèi)標(biāo)，雖然變成雙重PCR,但是對(duì)樣本的定量幾乎沒(méi)有影響。我公司的內(nèi)標(biāo)是為了克服外標(biāo)定量法而加入的標(biāo)準(zhǔn)品，主要目的是用

7、來(lái)監(jiān)測(cè)樣本的假陰性。此課件下載可自行編輯修改，僅供參考！感謝您的支持，我們努力做得更好！謝謝