雌雄性細(xì)胞的分離技術(shù)

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1、第十三章雌、雄性細(xì)胞的分離技術(shù)13.1引言性細(xì)胞：狹義、廣義性細(xì)胞：直接參加受精作用的雌、雄配子（卵細(xì)胞與精細(xì)胞）、花粉原生質(zhì)體、脫外壁花粉、胚囊。（合子、初生胚乳核）花粉原生質(zhì)體與脫外壁花粉的分離生殖細(xì)胞與精細(xì)胞的分離胚囊、卵細(xì)胞、合子與中央細(xì)胞的分離13.2花粉原生質(zhì)體與脫外壁花粉的分離花粉粒脫外壁花粉花粉原生質(zhì)體13.2.1花粉原生質(zhì)體80年代中期三條分離路線：1、化學(xué)脫壁：Southworth（1974）Loewus等（1985）多糖試劑MMNO2、酶法脫壁：Tanaka等（1987）麝香百合成熟花

2、粉的原生質(zhì)體周嫦（1988）鳶尾、萱草、風(fēng)雨花成熟花粉原生質(zhì)體和萱草幼嫩花粉原生質(zhì)體3、非酶法脫壁：Weaver等（1990）NaCl溶液滴加于菜豆成熟花粉成功四種分離方法：1、一步酶解法麝香百合、鳶尾、風(fēng)雨花的成熟花粉以及萱草不同發(fā)育時期的花粉原生質(zhì)體；單子葉植物百合科、鳶尾科、石蒜科等，雙子葉植物蕓薹屬。適用于具寬大萌發(fā)溝花粉的植物過程：花粉酶液水合膨脹外壁沿萌發(fā)溝裂開，內(nèi)壁大面積地暴露酶的作用下分解釋放出原生質(zhì)體2、水解-酶解二步法分兩步：花粉在溶液中充分水合，是外壁裂開，轉(zhuǎn)入酶液，降解內(nèi)壁，獲得原生

3、質(zhì)體甘藍型油菜與紫菜薹成熟花粉、凌霄花四種分離方法：3、萌發(fā)-酶解二步法分離煙草等植物的花粉原生質(zhì)體汪泳與周嫦（1995）建立步驟：成熟的花粉置于花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中，待花粉大量萌發(fā)，長出短花粉管時及時轉(zhuǎn)入酶液中酶解。酶液降解花粉管壁，再擴展至花粉內(nèi)壁，釋放出原生質(zhì)體注意：花粉管過長時，形成亞原生質(zhì)體。4、花藥預(yù)培養(yǎng)法分離煙草幼嫩花粉原生質(zhì)體，夏慧君等（1996）建立三步：花蕾低溫預(yù)處理收集花藥，將其漂浮在液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)中花藥裂開，花粉釋放到培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，大量的花粉外壁裂開。將裂外壁花粉轉(zhuǎn)入酶液。內(nèi)壁

4、被酶降解，外壁脫落，游離出花粉原生質(zhì)體。小結(jié)：根據(jù)不同植物花粉及其花粉壁的特點采取不同的分離方法。根據(jù)不同花粉發(fā)育時期，其形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理狀態(tài)的不同而用不同方法。分離方法與其細(xì)節(jié)可影響分離效果。如酶的種類、酶解時間、溫度、濃度等。13.2.2脫外壁花粉三種分離方法1、低滲水合法：將花粉置于低滲溶液中水合，使外壁脫落。蕓薹屬、風(fēng)雨花、荷花。2、花藥預(yù)培養(yǎng)法：煙草幼嫩花粉原生質(zhì)體法衍生三步：花蕾低溫預(yù)處理-花藥漂浮培養(yǎng)-酶解酶解時間短3、低溫水合-熱激-滲激法蕓薹屬脫外壁花粉分離的方法，分離出青菜與紫菜薹脫外壁花

5、粉三步：將花粉置于水合液中，低溫下較長時間水合——消除內(nèi)外壁的聯(lián)系，較好地保持花粉的生活力將花粉轉(zhuǎn)入較高溫度下作短時熱激處理再轉(zhuǎn)入低滲溶液，作短時震蕩滲激處理。13.3生殖細(xì)胞與精細(xì)胞的分離兩類分離方法：機械分離法滲透壓沖擊法13.3.1生殖細(xì)胞四種分離方法：1、一步滲透壓沖擊法花粉置于低滲蔗糖溶液中保溫一段時間后，花粉自行破裂，生殖細(xì)胞隨營養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)流出。棉花生殖細(xì)胞適用于花粉容易在蔗糖溶液中破裂的植物2、二步滲透壓沖擊法適用于花粉容易萌發(fā)的植物將花粉置于等滲蔗糖溶液中培養(yǎng)，當(dāng)大部分花粉開始萌發(fā)時，加入蒸餾

6、水使?jié)B透壓驟降，導(dǎo)致花粉管尖端破裂，釋放出生殖細(xì)胞。蠶豆、石蒜、風(fēng)雨花、玉簾、煙草、鳳仙花等四種分離方法：3、低酶法將花粉置于低濃度的酶溶液與低滲蔗糖溶液中保溫，促使花粉破裂釋放出生殖細(xì)胞。黃花菜、韭菜、朱頂紅、唐菖蒲、鳶尾等4、花粉原生質(zhì)體釋放法分離出花粉原生質(zhì)體，用滲透壓沖擊法或機械法使花粉原生質(zhì)體破裂，獲得生殖細(xì)胞。麝香百合分離出生殖細(xì)胞黃花菜、韭菜、鳶尾、唐菖蒲、朱頂紅、風(fēng)雨花等分離出花粉原生質(zhì)體局限性在于許多植物花粉原生質(zhì)體尚未分離成功。13.3.2精細(xì)胞三細(xì)胞花粉的精細(xì)胞分離：1、滲透壓沖擊法將

7、花粉置于含一定濃度滲透壓調(diào)節(jié)劑的介質(zhì)中，任其吸水后自行破裂而釋放精細(xì)胞。白花丹、玉米、小麥、甜菜等優(yōu)點：花粉壁不太破碎，碎片易于過濾清除?；ǚ郯l(fā)育時期與生理狀態(tài)對滲透壓沖擊效果有很大影響。2、研磨法將懸浮于一定介質(zhì)中的花粉用玻璃勻漿器或其他裝置輕輕研磨，使花粉破裂而又不損傷精細(xì)胞。油菜、甘藍、紫菜薹、非洲菊、菠菜等優(yōu)點：手續(xù)簡便，不過分依賴花粉的成熟度與生理狀態(tài)。但研磨需要手工技巧，且研磨后花粉壁碎片較難清除。二細(xì)胞花粉的精細(xì)胞分離1、花粉離體培養(yǎng)法花粉在培養(yǎng)基中人工萌發(fā)，待形成精細(xì)胞后，應(yīng)用滲透壓沖擊法或

8、研磨使花粉管破裂。百合、藍豬耳人工萌發(fā)的花粉管在精細(xì)胞形成上常不同步，由此分離的精細(xì)胞群體中不免混雜一些尚未分裂的生殖細(xì)胞，使精細(xì)胞純度降低。2、活體-離體法Shivanna等（1988）首創(chuàng)，分離杜鵑與唐菖蒲精細(xì)胞將花粉授于柱頭上，切下花柱插入培養(yǎng)基，待眾多花粉管中已形成精細(xì)胞，花粉管自花柱切口長出，然后用滲透壓沖擊或酶法促使花粉管尖端破裂。莫永勝與楊弘遠（1992）5科8種（鳶尾、棉花、朱頂紅、煙草、黃花菜、