WB操作步驟-自己整理.docx

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1、WesternBlot相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法與試劑（濕轉(zhuǎn)法）人工肝實(shí)驗(yàn)室學(xué)習(xí)姚瑤（一）目的蛋白提取：（1）單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?、倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入Hanks液洗滌一次后倒掉，根據(jù)所用細(xì)胞決定是否用胰酶消化，加入適量（約5ml）新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液后，將貼壁細(xì)胞吹起，并轉(zhuǎn)移至4支離心管內(nèi)，配平后，1500轉(zhuǎn)離心10min。2、倒掉上清，用4度預(yù)冷PBS溶液洗滌沉淀，1500轉(zhuǎn)離心10min。共洗三次，每次十分鐘。3、倒掉上清，吸凈，每管加入50ul細(xì)胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的釋放可迅速變粘稠，故應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管內(nèi)，-20℃裂解30min。

2、4、超聲波細(xì)胞裂解儀上將各管裂解15s。（可不做）5、4℃，12000轉(zhuǎn)離心10min。6、將上清轉(zhuǎn)移至0.5mlEP管中，每管100ul，冰浴待用。（2）組織中總蛋白的提?。?、取約100mg肝組織于研磨器內(nèi)，加入500ul細(xì)胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5mlEP管內(nèi)，再加入500ulRIPA，研磨后吸出于上EP管內(nèi)。冰上裂解30min。2、配平后，4℃，14000轉(zhuǎn)離心10min。3、將上清分裝于0.5mlEP管內(nèi)，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的測(cè)定：1、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：10ul標(biāo)準(zhǔn)品C液+90ulPBS溶液，混勻。2、按0、1、2、4、8、

3、12、16、20ul將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品加入于96孔板內(nèi)，并用PBS將各孔補(bǔ)足20ul。3、將第2、3排96孔板分別加入樣品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀釋法），并用PBS將各孔補(bǔ)足20ul。4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制適量工作液，每孔加入200ul。5、37℃水浴30min。6、酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值（A570，Mode1）。7、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蛋白濃度。（三）SDS-PAGE電泳：（1）清洗玻璃板（2）灌膠與上樣：1、配膠：根據(jù)目的蛋白的大小，決定分離膠的濃度。分子量范圍凝膠濃度（%）（KB）525-2001010-7015<5020<

4、40以5ml10%分離膠、3ml5%濃縮膠為例：10%分離膠5%濃縮膠去離子水1.9ml2.1ml30%聚丙烯酰胺1.7ml0.5ml1.5MTris-HCl（Ph8.8）1.3ml------1.0MTris-HCl（Ph6.8）-------380ul10%SDS50ul30ul10%AP50ul30ulTEMED2ul3ul2、處理蛋白：計(jì)算含20-50ug蛋白的溶液體積即為上樣量，加入上樣量等體積的2×上樣緩沖液Buffer，再加入上述總體積1/10的β-巰基乙醇，混勻后，放入PCR儀內(nèi)，95℃反應(yīng)10min。3、加樣：加入1×Tris-甘氨

5、酸電泳液，電泳液至少要漫過內(nèi)側(cè)小玻璃板，取下梳子，安裝好電泳槽，倒入緩沖液，微量加樣器加樣。需在外槽電泳緩沖液中洗滌數(shù)次，以免交叉污染。（3）電泳：100V，20min，待溴酚藍(lán)成一直線后，150V，電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳(一般1.5h)，取出跑好的凝膠，切膠至適合大小。進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。也可在轉(zhuǎn)膜前驗(yàn)證是否有目的條帶，使用考馬斯亮藍(lán)液置于搖床染色12h。染完后觀察，用脫色液脫色，20min/次，直至透明。再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。（四）轉(zhuǎn)膜：配制1×轉(zhuǎn)膜緩沖液（現(xiàn)配）。一般配制成10×轉(zhuǎn)膜緩沖液儲(chǔ)存。需要時(shí)配制成1×現(xiàn)用。PVDF膜需用甲醇激活(15s)，注意戴手套、趕

6、走氣泡、膠與膜的位置、膜的正反面。放置順序?yàn)椋汉＞d--濾紙2層—PVDF膜—凝膠--濾紙2層—海綿。（大小：凝膠>濾紙>PVDF膜）（五）免疫反應(yīng)：1、5%脫脂奶粉封閉，4℃過夜。2、一抗孵育。3、洗膜：PBST/TBST洗膜3次，10min/次。4、二抗孵育。5、洗膜：PBST/TBST洗膜3次，10min/次。（六）顯色：將HyGLO試劑A750ul與試劑B750ul混合后，均勻地滴于膜正面，約1min后，抖掉膜上液體，并吸干后顯色。在WesternBlotting實(shí)驗(yàn)過程中使用內(nèi)參的方法有：一、超級(jí)簡(jiǎn)便的標(biāo)記內(nèi)參使用法：只要在二抗孵育時(shí)加入HRP標(biāo)記內(nèi)

7、參抗體，按照正常操作即可。二、普通內(nèi)參：當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí)，可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測(cè)。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測(cè)。三、當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量?jī)刹糠?，使?nèi)參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育，二抗溫育以及顯色。麗春紅染色劑是一種陰離子重氮染料，由重氮氨基偶氮苯二磺酸（diazotized4-amino-1,

8、1’-azobenzene-3,4’-disulfo